高效誘導人胚胎干細胞分化為表達生殖功能調控相關基因的下丘腦神經細胞

徐瑜辰，覃蓮菊，寧松，曹孟，李真真，崔毓桂，馬翔，劉嘉茵

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科/生殖醫學國家重點實驗室，南京 210029)

下丘腦是調節機體穩態平衡的中樞，通過分泌多種神經遞質和神經肽，調控人體能量代謝、生殖功能、免疫功能、應激反應和晝夜節律[1-2]。下丘腦主要由弓狀核(ARC)、腹內側核(VMH)、背內側核(DMH)和室旁核(PVN)這幾種功能不同的核團組成[3]。人下丘腦ARC中存在表達阿片促黑素皮質素原(POMC)和神經肽Y/刺鼠相關肽(NPY/AGRP)基因的神經元，這些神經元能對與代謝相關的外周信號激素如胰島素、瘦素、饑餓素產生應答，并通過分泌多種神經肽來調控機體的食物攝入與能量消耗[4]。ARC中還有表達親吻素1(KISS1)基因的神經元，通過分泌親吻肽(Kisspeptin)作用于促性腺激素釋放激素(GnRH)神經元，從而影響GnRH的分泌，調控生殖功能[5-7]。此外，越來越多的研究表明，代謝因素會影響KISS1的表達[8-9]，而Kisspeptin信號通路的異常同樣會引起代謝相關疾病[10-12]。因此，深入了解下丘腦ARC中不同亞型神經元在維持人體代謝與生殖功能平衡中的細胞生理學機制尤為重要，但目前很難直接獲得人類下丘腦神經細胞用于體外疾病研究。

人類多能干細胞(hPSCs：包括人胚胎干細胞hESCs，以及人誘導多能干細胞hiPSCs)具有體外擴增能力和多向分化潛能，在適當的培養條件下可分化為三胚層來源的所有細胞類型[13]，包括神經細胞[14-15]。2008年，Wataya等[16]基于小鼠下丘腦神經細胞發育過程中的分子調控機制，在體外將小鼠胚胎干細胞(mESCs)誘導分化為下丘腦類型的神經前體細胞。2015年，Merkle等[17]成功誘導hPSCs分化為具有分泌神經肽功能的下丘腦神經細胞。Wang等[18-19]開發了一種將hPSCs分化為類下丘腦弓狀核神經細胞(HANs)的實驗方案，并證實這些神經細胞與人體內HANs的功能極為相似。體外定向誘導hPSCs分化為下丘腦神經細胞，可有效解決研究用人類神經細胞模型問題。

雖然以往研究證實了從hESCs或hiPSCs誘導分化的類HANs表達代謝相關基因如POMC、NPY/AGRP等[18-20]，但這些神經細胞是否表達參與生殖功能調控相關基因尚未得到證實。本研究優化現有體外誘導hESCs向類HANs分化方案，并進一步分析生殖內分泌相關基因在分化神經細胞中的表達情況，探討該類神經細胞可否作為細胞模型應用于下丘腦ARC在生殖相關疾病發生、發展過程中的調控機制研究。

材料和方法

一、細胞及試劑

1.細胞：利用接受輔助生殖技術治療患者捐贈的冷凍女性胚胎，建立hES細胞系[21]，命名為CCRM14。經過南京醫科大學、南京醫科大學第一附屬醫院的倫理委員會審查通過，捐獻者簽署知情同意書。

2.主要試劑：Knockout DMEM、血清替代物(Knockout Serum Replacement)、B27、N2添加物(N2-supplement)、IV型膠原蛋白酶(Collagenase IV)、中性蛋白酶(Dispase)、胰蛋白酶-EDTA[Trypsin-EDTA(0.25%)]、Natural mouse laminin(Thermo Fisher，美國)；β-巰基乙醇(β-mercraptoethanol)(Biolink，美國)；基質膠(Matrigel)(BD Biosciences，美國)；堿性成纖維細胞生長因子(FGF-basic)(Pepro Tech，美國)；mTeSRTM1 cGMP，feeder-free maintenance medium for human ES and iPS Cells(Stem Cell，加拿大)；SB431542、Purmorphamine(Stemgent，美國)；LDN-193189、Y-27632(Selleckchem，美國)；DAPT(TOCRIS，美國)；SHH、BDNF(R&D，美國)；D-Glucose、Ascorbic Acid、Poly-L-ornithine(Sigma，美國)。所用抗體見表1。

表1 抗體信息

3.主要儀器：流式細胞儀(型號：Navios)、臺式冷凍離心機(型號：AllegraX-30)(Beckman，美國)；激光共聚焦顯微鏡(型號：C2 plus)、生物顯微鏡(型號：TS100-F)(Nikon，日本)；三氣培養箱(型號：Thermo-3131)(Thermo，美國)。

二、研究方法

(一)類HANs的體外誘導分化

體外誘導hESCs分化為類HANs的實驗方案包括三個主要步驟。第一步：在以小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的飼養層上培養hESCs(CCRM14)，并在無飼養層培養系統中純化；第二步：依次加入SB431542、LDN-193189、SHH、Purmorphamine、DAPT等分子，誘導hESCs分化為特異性表達NKX2-1的下丘腦神經前體細胞(HNPs)；第三步：依次加入DAPT、腦源性神經營養因子(BDNF)，誘導HNPs分化為類HANs(圖2)。

1.hESCs的培養：CCRM14以MEF為飼養層、在ESC完全培養基[組成：DMEM/F12、20%血清替代物、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、1%青霉素鏈霉素，10 ng/ml 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)]中進行常規培養，每5～7 d傳代。

2.hESCs的純化：為去除飼養層對誘導神經分化的影響，采用無飼養層培養系統對hESCs進行純化培養。在hESCs克隆生長至接近匯合時，加入Collagenase Ⅳ-Dispase混合液[1 mg/ml Collagenase Ⅳ∶1 mg/ml Dispase(v/v)=1∶1，DMEM/F12配制]；放入5% CO2、37℃培養箱內消化約35 min；收集與MEF分離并脫落的hESCs克隆至15 ml離心管內，待其自然沉降至管底；吸棄酶液，加入ESC培養基洗滌3次。按照1∶2或1∶3的傳代比例，接種于Matrigel包被的培養板內，加入適量mTeSR1培養基培養3～5 d，至hESCs 克隆接近匯合。加入0.25% Trypsin-EDTA，消化約3 min，使hESCs為單細胞；加入KSR培養基(組成：knockout DMEM、14.75%血清替代物、1.07% GlutaMAX、1.07%非必需氨基酸、1.07%青霉素鏈霉素、0.06 mmol/L β-巰基乙醇)中和并離心，懸浮細胞并計數。按適量密度接種細胞于Matrigel包被的培養板中(6孔板：1.0×106細胞/孔；12孔板：3.0×105細胞/孔；24孔板：1.5×105細胞/孔)；加入適量KSR培養基，并加入bFGF(10 ng/ml)和ROCK抑制劑Y27632(10 μM)培養約1 d。顯微鏡下觀察到hESCs細胞密度長至95%以上時，即可開始誘導神經分化。

3.誘導hESCs分化為HNPs：將開始誘導神經分化記為第1天(Day 1)。Day 1～4：加入KSR分化培養基(組成：KSR培養基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)，培養4 d。Day 5：加入KSR/N2混合分化培養基A[組成：3份KSR培養基、1份N2培養基(N2培養基組成：DMEM/F12、1.04% GlutaMAX、1.04%非必需氨基酸、1.04%青霉素鏈霉素、1.04% N2添加物、1.04% D-Glucose(16%)、0.2 mmol/L Ascorbic Acid)、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189]培養1 d。Day 6：加入KSR/N2混合分化培養基B(組成：1份KSR培養基、1份N2培養基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)培養1 d。Day 7：加入KSR/N2混合分化培養基C(組成：1份KSR培養基、3份N2培養基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)培養1 d。Day 8：加入N2分化培養基A(組成：N2培養基、100 ng/ml SHH、2 μmol/L PM、10 μmol/L SB431542、2.5 μmol/L LDN-193189)培養1 d。Day 9～12：加入N2分化培養基B(組成：N2培養基、0.02% B27、10 μmol/L DAPT)培養4 d。需每天更換新鮮培養基。至分化第12天，hESCs即分化為HNPs。

4.誘導HNPs分化為類HANs：Day 13加入TrypLE，消化HNPs約4 min，將細胞吹打為單細胞懸液，離心、棄上清液，加入適量N2分化培養基C(組成：N2培養基、0.02% B27、10 μmol/L ROCK抑制劑)重懸細胞并細胞計數。以適當密度(6孔板：1.0×106細胞/孔；12孔板：3.0×105細胞/孔；24孔板：1.5×105細胞/孔)接種至Poly-L-ornithine/Laminin包被的培養板中，加入適量N2分化培養基C，培養約3 h后更換培養基為N2分化培養基B，培養4天，每天更換新鮮培養基。Day 17開始，更換培養基為N2分化培養基D(組成：N2培養基、0.02% B27、20 ng/ml BDNF)，培養2～3周，每2天更換新鮮培養基，直到類HANs成熟。

(二)細胞流式分析

加入TrypLE，將hESCs和HNPs消化為單細胞，離心、棄上清，PBS重懸。加入Fixation Buffer(Biolegend)，4℃避光固定30～60 min。使用1×Permeabilization Wash Buffer(Biolegend，10×)破膜5 min，PBS重懸細胞。加入一抗，4℃孵育至少30 min，PBS洗滌后加入二抗，4℃避光孵育30 min。0.1% BSA洗滌并重懸，上機檢測。共分析3個代次(P33～35)的CCRM14及其誘導分化的HNPs。其中：兔多克隆抗體OCT4(1∶33)，兔單克隆抗體Nanog(1∶33)，小鼠單克隆抗體SSEA4(1∶33)，小鼠單克隆抗體Tra-1-81(1∶17)抗體用于檢測CCRM14干細胞多能性；兔單克隆抗體TTF1(NKX2-1)(1∶33)，小鼠單克隆抗體Nestin(1∶33)抗體用于檢測神經前體細胞。山羊抗小鼠二抗(1∶100)或山羊抗兔二抗(1∶100)。

(三)細胞免疫熒光檢測

用4%多聚甲醛室溫固定在蓋玻片上培養的細胞30 min，PBS洗3遍，每次5 min。0.4% Triton X-100冰上破膜10 min，PBS洗3遍，使用5%BSA 37℃封閉30 min。孵育一抗4℃過夜，次日PBS 洗3遍，室溫避光孵育二抗1 h，PBS 洗滌后加入含DAPI的封片劑封片，利用熒光倒置顯微鏡觀察拍照。所用抗體如下：用于鑒定CCRM14干細胞多能性一抗：兔多克隆抗體Oct4(1∶200)、兔多克隆抗體Nanog(1∶200)、小鼠單克隆抗體SSEA4(1∶500)、小鼠單克隆抗體TRA-1-81(1∶200)；用于鑒定HNPs一抗：兔單克隆抗體TTF1(NKX2-1)(1∶200)、小鼠單克隆抗體Nestin(1∶100)、兔多克隆抗體FOXG1(1∶200)、山羊多克隆抗體SOX1(1：500)、兔多克隆抗體MASH1(1∶200)、小鼠單克隆抗體PAX6(1∶200)、兔單克隆抗體AR(1∶50)、小鼠單克隆抗體KiSS-1(1∶50)；用于鑒定類HANs一抗：小鼠單克隆抗體POMC(1∶200)、小鼠單克隆抗體NPY(1∶100)、兔多克隆抗體AGRP(1∶100)、兔單克隆抗體AR(1∶50)、小鼠單克隆抗體KiSS-1(1∶50)。二抗為山羊抗兔(1∶500)、山羊抗小鼠(1∶500)和驢抗山羊二抗(1∶200)。

(四)RT-qPCR分析基因表達

表2 RT-qPCR引物序列

三、統計學分析

結 果

一、CCRM14建系及鑒定

復蘇冷凍胚胎，培養至囊胚內細胞團(ICM)出現，分離ICM轉移至飼養層培養，經傳代、擴增，成功建立hES細胞系CCRM14。CCRM14在飼養層上呈克隆狀生長；免疫熒光實驗結果顯示，CCRM14表達干細胞多能性標志物 OCT4、NANOG、SSEA4、TRA-1-81(圖1A)。流式細胞學檢測結果顯示，CCRM14多能性標志物的陽性表達率依次為OCT4(97.82±0.46)%、NANOG(97.70±0.27)%、SSEA4(97.01±0.59)%、TRA-1-81(97.23±0.52)%(圖1B)。使用不含bFGF的ESC培養基懸浮培養CCRM14克隆，可觀察到擬胚體(EB)的形成(圖1C)。檢測EB在培養第0、3、7和14 d時的基因表達水平，發現多能性標志基因OCT4表達水平隨分化進程下降，而內胚層標志基因SOX17、中胚層標志基因CD31以及外胚層標志基因NESTIN的表達水平則隨分化進程先增加，而后隨著向特異性組織的分化呈下降趨勢(圖1D)。以上研究結果表明：CCRM14具有典型hESCs特征。

A：免疫熒光檢測顯示CCRM14表達多能性標志物OCT4、NANOG、SSEA4和TRA-1-81，標尺=100 μm；B：流式細胞學檢測CCRM14細胞表達多能性標志物陽性率(共檢測3個代次：P33～35)；C：CCRM14體外懸浮培養形成EB，標尺=500 μm；D：CCRM14來源的EB三胚層分化特異標志基因SOX17(內胚層)、CD31(中胚層)、NESTIN(外胚層)的表達情況圖1 CCRM14細胞系的鑒定

二、誘導CCRM14向HNPs分化并鑒定

本研究對已報道誘導分化方案[19]進行了優化，即誘導神經細胞誘導分化之前增加了hESCs純化步驟(圖2A)。MEF上培養的CCRM14呈類圓形克隆樣生長(圖2B-a)；使用Collagenase Ⅳ-Dispase消化之后，MEF仍然貼壁、而hESCs克隆完整游離后留下印跡(圖2B-b)。游離的純化hESCs克隆轉移至基質膠上培養，初時呈鋪路石樣，后逐漸長至匯合、辨不清細胞形態(圖2B-c)。用0.25% Trypsin-EDTA消化為單細胞后接種于新培養皿，貼壁后細胞形態均一、伴高核質比(圖2B-d)。分化至Day 12時，快速增殖的細胞顯示積聚重疊狀(圖2B-e)。分化至Day 34時，鏡下可見神經細胞樣細胞(圖2B-f)。

收集Day 0和分化Day 12的細胞樣本，檢測多能性標志基因和HNPs特異基因表達情況。RT-qPCR檢測結果顯示(圖3A)，Day 0細胞高水平表達干細胞多能性標志基因OCT4、NANOG；Day 12分化細胞的OCT4(P<0.0001)和NANOG(P<0.001)表達水平顯著降低，同時HNPs標志基因NKX2-1(P<0.0001)、神經細胞標志基因NESTIN(P<0.01)、MASH1(P<0.01)和神經前體細胞標志基因SOX1(P<0.0001)的mRNA相對表達量顯著上調；而端腦類型神經細胞標志基因PAX6(P<0.01)、FOXG1(P=0.30)的表達水平則隨著細胞向腹側間腦細胞類型的分化而降低。免疫熒光檢測結果與RT-qPCR檢測結果一致：Day 12分化細胞均表達NESTIN、NKX2-1、MASH1和SOX1，不表達PAX6和FOXG1(圖3B)。流式細胞學檢測結果顯示，Day 12分化細胞中，(99.11±0.30)%的細胞顯示神經細胞標志物NESTIN強陽性；同時(96.76±3.24)%的細胞顯示HNPs標志物NKX2-1強陽性(圖3C)，均高于之前報道的分化方案[19，22]。以上結果表明，本優化方案可以更高效率分化為HNPs。

三、誘導HNPs向類HANs分化并鑒定

更換誘導培養基，加入BDNF，繼續誘導HNPs向類HANs亞群分化(圖2A)。收集Day 34細胞樣本，檢測多能性標志基因和HANs特異基因表達情況。RT-qPCR檢測結果顯示：干細胞多能性標志物OCT4、NANOG的表達水平隨分化進程顯著降低(P<0.0001)；而神經細胞標志物NESTIN(P<0.05)、ARC神經細胞特異性標志物POMC(P<0.05)、NPY(P<0.05)和AGRP(P<0.001)的表達水平均顯著升高(圖4A)。免疫熒光檢測結果與RT-qPCR檢測結果一致：大部分 Day 34的分化細胞均高水平表達POMC、NPY和AGRP(圖4B)。以上結果表明，加入BDNF繼續誘導兩周以上，HNPs可分化為ARC神經細胞。

A：體外誘導CCRM14向類HANs分化的流程圖。hESCs在MEF上培養6 d，純化后在Matrigel上培養4 d，然后消化為單細胞、誘導向神經細胞分化(將開始誘導當天記為第1天)；培養至第12天收獲HNPs，轉移至Poly-L-ornithine/Laminin上繼續培養至第34天時收獲類HANs。其中ESC、mTeSR1、KSR和N2為培養基，Y27632(ROCK抑制劑)、bFGF(FGF-basic)、SB(SB431542)、LDN(LDN-193189)、SHH、PM(Purmorphamine)、B27、DAPT和BDNF為添加因子；B：顯微鏡下CCRM14向類HANs分化不同階段細胞形態：a，MEF上培養CCRM14第6天(Day-5)時形態；b，Day-4時使用Collagenase Ⅳ-Dispase游離CCRM14克隆之后的MEF；c，Matrigel上培養CCRM14至第3天(Day-1)的細胞形態；d，Day1時CCRM14消化為單細胞再接種、貼壁后細胞形態；e，CCRM14分化至Day12的細胞形態；f，CCRM14分化至Day34的細胞形態；標尺=500 μm圖2 體外誘導CCRM14向類HANs分化方案

A：RT-qPCR檢測分化Day 0和Day12細胞的多能性標志基因OCT4、NANOG；HNPs特異性標志基因NKX2-1；神經細胞標志基因NESTIN、MASH 1；神經前體細胞標志基因SOX1；端腦類型神經細胞標志基因PAX6、FOXG1的表達，**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001；B：免疫熒光檢測分化Day12細胞NKX2-1、NESTIN、MASH1、SOX1、PAX6、FOXG1的表達；標尺=100 μm；C：流式細胞學檢測分化Day12細胞NESTIN、NKX2-1的陽性表達率分別為(99.11±0.30)%、(96.76±3.24)%圖3 CCRM14誘導分化至第12天時鑒定HNPs

四、檢測CCRM14來源的HNPs和類HANs中生殖功能相關基因的表達

我們進一步檢測分化的神經細胞是否表達生殖功能調控相關基因。細胞免疫熒光實驗結果顯示，大部分Day12分化細胞(HNPs)和Day34分化細胞(類HANs)中，均顯著表達參與生殖功能調控相關基因KISS1和AR(圖5)。

A：RT-qPCR檢測分化Day 0和Day34細胞的多能性標志基因OCT4、NANOG；神經細胞標志基因NESTIN；HANs標志基因POMC、NPY、AGRP的表達，*P<0.05、**P<0.01、****P<0.0001;B：免疫熒光檢測分化Day34細胞POMC、AGRP、NPY的表達；標尺=100 μm圖4 CCRM14誘導分化至第34天時鑒定類HANs

免疫熒光檢測分化Day 12、Day 34細胞KISS1和AR的表達；標尺=100 μm圖5 檢測CCRM14來源下丘腦神經細胞中參與生殖功能調控相關基因的表達

討 論

維持hESCs自我更新能力和多能性最常用的體外培養方法是飼養層支持培養[23]。之前報道的體外誘導hESCs向神經細胞分化方案中，或通過酶法利用TrypLE直接將hESCs連同飼養層一起消化為單細胞[19]，或通過機械法將hESCs克隆逐一挑出進行傳代及后續分化[24]，亦或直接將hESCs接種于無飼養層的Matrigel上進行增殖傳代用于分化[17-18，20，22]。酶法無法分離hESCs和飼養層細胞，不能排除飼養層細胞對后續誘導分化的影響；機械法雖能很好地分離hESCs和飼養層細胞，但操作難度大、耗時長，會使hESCs過長時間暴露于非培養環境，不利于之后的誘導分化；直接利用無飼養層培養成本高，且不利于規模化獲得神經細胞。

本研究中，在誘導分化為神經細胞前，增加了hESCs的純化步驟，利用hESCs、MEF對Collagenase Ⅳ和Dispase兩種酶的敏感性差異，有效地分離了hESCs和MEF，且時間短、易于操作，同時避免了飼養層以及過長時間暴露于非培養環境對后續誘導分化實驗的影響。本研究中誘導分化前的hESCs純度>97%(圖1B)；而HNPs 的NESTIN陽性率達99.11%、NKX2-1陽性率達96.76%，較先前文獻報道的80%以上的分化效率大幅提高[19，22]。本優化方案便捷、可靠、效率高，將來可促進神經細胞領域的研究。此外，我們的研究結果也表明了高純度的hESCs更易于誘導分化為特定細胞群體，對高效誘導hESCs向其它類型細胞分化具有借鑒作用。

現有研究表明從hPSCs分化的下丘腦神經細胞與其在人體內對應的神經細胞有著極為相似的特征和功能[17-18，25]，直接使用hPSCs誘導分化出的人體細胞進行基因篩選和機制研究，可克服利用動物進行研究時的耗時長、成本高等缺陷，同時也更易于獲得與人體內研究一致結果，這為研究人類中樞神經系統疾病發病機制提供了理想的細胞模型。此外，與大腦中復雜環境不同的是，體外下丘腦神經細胞培養系統的復雜性低，使得在體外直接檢測化學物質或藥物對神經元功能的影響成為可能。目前，多種神經發育性疾病[26]，神經退行性疾病[27]和代謝性疾病[20，28]，已利用hPSCs成功構建了相關的疾病模型，用于闡明疾病發生、發展的線索以重現病因。

本研究獲得的HNPs和類HANs，在蛋白水平上均能表達生殖功能調控相關基因KISS1以及參與雄激素應答的基因AR，提示該類神經細胞可作為細胞模型用于研究下丘腦神經細胞在生殖相關疾病中的調控作用及機制，同時為研究代謝與生殖功能之間的相互影響構建橋梁。不足的是，本研究尚未驗證獲得的類HANs是否能分泌具有生物學功能的神經肽類激素，本研究小組將在后續研究中完善該類神經細胞的功能鑒定。后續研究中，本研究小組將進一步驗證所獲得的類HANs的分泌功能，為建立探討生殖與代謝疾病在中樞神經系統水平上的發病機制提供細胞模型。