小劑量GnRH-a誘發后的促排卵方案在卵巢低儲備患者高基礎雌激素狀態下的應用

秦寧馨，沈曦，郜虹媛，葉靜，朱秀嫻，呂祁峰，陳秋菊，匡延平*

(1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，上海 200011;2.上海交通大學醫學院，上海 200020)

在對不孕癥患者行IVF/ICSI-ET助孕過程中，我們發現卵巢低儲備(diminished ovarian stimulation，DOR)患者的治療尤為困難。盡管DOR目前的診斷標準多種多樣[1-2]，但由于卵子數量和(或)質量的下降[2-5]，DOR患者的多種促排卵方案均存在可用胚胎數少、臨床妊娠率低的問題[6]。

基礎FSH、基礎E2(B-E2)、AFC、AMH等常用于DOR患者卵巢儲備的預測和評估[7-10]。其中B-E2過高和過低均提示不良的臨床結局，B-E2≤73.4 pmol/L或≥275.3 pmol/L的患者往往預示卵巢反應不良、周期取消率高及胚胎種植率低[11-18]。因此我們將B-E2≥275.3 pmol/L定義為高基礎雌激素狀態。然而對DOR患者而言，由于在前次黃體期發生較早的選擇和優勢化，使得月經周期縮短，在月經期往往伴隨出現較大的優勢卵泡和較高的雌激素水平，因此DOR患者更容易出現高基礎雌激素狀態。當B-E2≥275.3 pmol/L時，普通促排卵方案效果不佳，周期取消率明顯升高，甚至有人建議考慮在月經期直接取消周期。

DOR患者反復的高基礎雌激素狀態造成了較高的周期取消率，延誤了治療時間，給患者帶來了極大的心理負擔和經濟負擔。基于既往研究，本中心模擬黃體期促排卵模式，在月經期使用小劑量促性激素釋放激素激動劑(GnRH-a，0.1 mg)進行誘發，次日開始使用口服孕激素和克羅米芬(CC)聯合促性腺激素(Gn)進行卵巢促排卵，并觀察臨床結局。以期尋找更適合DOR患者高基礎雌激素狀態下的卵巢促排卵方案，為DOR患者的IVF/ICSI治療提供新思路。

資料與方法

一、研究對象

本研究納入2015年1月至2017年1月期間，于我院行IVF/ICSI治療的卵巢低儲備患者50例，并將在此期間所有IVF/ICSI周期均納入本研究，依據助孕周期B-E2水平是否升高分為兩組。

納入標準：(1)不孕癥診斷明確，有明確進行IVF/ICSI治療的指征；(2)符合卵巢低儲備的標準：①基礎FSH≥12 U/L；②AFC≤4個；③年齡≥42歲。三項中至少符合兩項；(3)至少一個IVF/ICSI周期符合B-E2≥275.3 pmol/L；(4) 近3個月未接受任何生殖激素類藥物治療者。

患者排除標準：(1)合并III度及以上的子宮內膜異位癥患者；(2)合并高泌乳素血癥患者；(3)有嚴重器質性疾病或精神疾病不適合妊娠的患者。

二、分組及治療方案

依據50例入組患者B-E2不同水平將IVF/ICSI周期分為兩組：實驗組，針對B-E2≥275.3 pmol/L的周期，從月經周期第2～5天開始應用小劑量GnRH-a誘發后的卵巢促排卵方案；對照組，針對B-E2<275.3 pmol/L的周期，應用常規的卵巢促排卵方案。

(一)實驗組

當入組患者B-E2≥275.3 pmol/L伴或不伴優勢卵泡出現，從月經第2～5天開始應用小劑量GnRH-a誘發后的卵巢促排卵方案。月經周期第2～5 d皮下注射醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌制藥，荷蘭)0.1 mg，注射后當日開始口服安宮黃體酮(MPA，浙江仙琚藥業)10 mg/d和克羅米芬(CC，高特制藥，塞浦路斯)50 mg/d，注射后次日開始肌肉注射HMG(樂寶得，上海麗珠)150 U/d或225 U/d，超聲監測、靜脈血性激素監測方法同卵巢正常儲備患者。當有1個以上優勢卵泡的直徑達到20 mm或3個以上的優勢卵泡直徑達到18 mm以上時，皮下注射醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌制藥，荷蘭)0.1 mg并聯合肌肉注射HCG(珠海麗珠)1 000～5 000 U 以誘發排卵，誘發排卵36～38 h后在陰道超聲引導下行取卵術。

(二)對照組

當入組患者B-E2<275.3 pmol/L且月經期無優勢卵泡出現，從月經第2～5天開始應用常規IVF/ICSI周期治療方案，依據采用方案的不同分為3個亞組：卵泡期對照組、黃體期對照組和自然周期對照組。

1.卵泡期對照組：包括安宮方案和輕微刺激方案。(1)安宮方案：從月經第2～5天開始口服MPA 10 mg/d，同時肌肉注射HMG 75 U/d或150 U/d，促排卵治療過程中根據卵泡的發育情況和血清中的激素水平，及時調整MPA和HMG的用量，誘發排卵方法同卵巢正常儲備患者，誘發排卵36～38 h后在陰道超聲引導下行取卵術。(2)輕微刺激方案：從月經第2～5天開始口服來曲唑片(芙瑞，江蘇恒瑞藥業)2.5 mg/d×4 d，同時口服CC 25 mg/d×7 d，服藥第4 d開始每天肌肉注射HMG 75 U或隔天肌肉注射150 U，促排卵治療過程中根據卵泡的發育情況和血清中的激素水平及時調整HMG的用量，誘發排卵方法同卵巢正常儲備患者，誘發排卵34～36 h后在陰道超聲引導下取卵。

2.黃體期對照組：當患者取卵術后陰道超聲提示直徑小于10 mm的卵泡數≥3個時，術后當日開始口服CC 50 mg/d，同時肌肉注射HMG 150 U/d或225 U/d，超聲、性激素監測方法及誘發排卵方法同安宮方案。

3.自然周期對照組：從月經第10天或患者自測排卵試紙陽性日開始陰道超聲、血清性激素監測卵泡。當優勢卵泡直徑≥16 mm，E2≥734 pmol/L且LH≤20 U/L時，當晚23：00皮下注射達必佳0.1 mg或肌肉注射HCG 5 000 U誘發排卵，32～34 h后行取卵術。若夜針次日E2下降二分之一及以上，則立即安排提早取卵。若優勢卵泡直徑≥16 mm、E2≥734 pmol/L且LH>20 U/L，則當天15：00注射GnRH-a或HCG，次日監測血清性激素，若E2下降二分之一及以上則安排上午取卵，若下降二分之一以內或上升則安排下午取卵。

(三)常規取卵術、IVF/ICSI-ET與胚胎觀察

常規陰道消毒，在陰道超聲引導下，采用雙腔取卵針，抽取直徑>10 mm卵泡，如卵泡液中未見卵冠丘復合物，用培養液沖洗卵泡腔以及取卵針，再抽取。取卵后根據精子情況或既往受精情況采用常規IVF、ICSI或IVF+ICSI授精。取卵后18 h觀察受精情況，72 h觀察胚胎卵裂情況。依據形態學對72 h胚胎進行分級：I級：卵裂球大小均勻，胞質均質透明，無碎片；II級：卵裂球均勻，碎片<20%；III級：卵裂球大小不均等，碎片較多(20%～50%)；IV級：卵裂球不均等，碎片>50%。本中心采用全胚冷凍策略(freeze-all policy)，取卵周期I級及II級優質胚胎以玻璃化方法進行冷凍保存，剩余胚胎繼續培養至囊胚后冷凍保存，擇期行冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)，FET內膜準備方案參照常規[19]。

三、觀察指標

主要觀察指標：可用胚胎數，周期取消率=無可用胚胎的周期數/取卵周期總數×100%；次要觀察指標：正常受精卵數，卵裂數，優質胚胎數，獲卵率=獲卵數/穿刺卵泡數×100%，卵子利用率=可用胚胎數/獲成熟卵數×100%，胚胎種植率=宮內妊娠囊數/移植胚胎總數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠的周期數/移植周期總數×100%，累積活產率=活產數/取卵周期數×100%(均特指無剩余可用胚的取卵周期)。

四、統計學方法

結 果

一、患者基本信息

50位入組的DOR患者平均年齡(36.9±5.1)歲，BMI(21.4±2.3)kg/m2，平均既往移植失敗0(0，1.0)次，不孕年限4.0(3.0，6.0)年，既往妊娠0.5(0，1.0)次，既往產次0(0，0)次。

二、實驗組和對照組IVF/ICSI周期特征

50位患者共進行50個實驗組和128個對照組IVF/ICSI治療周期，其中卵泡期對照組92個(87個安宮方案，5個微刺激方案)，黃體期對照組19個和自然周期對照組17個。50 例患者所進行的對照組治療周期數最少為1個周期，最多為7個周期。

實驗組、卵泡期對照組、黃體期對照組三組間周期治療天數無統計學差異(P>0.05)。實驗組、卵泡期對照組和黃體期對照組HMG用藥天數分別有統計學差異(P<0.05)，黃體期對照組顯著高于另外兩組(P<0.05)。

周期開始時FSH水平黃體期對照組高于其他三組，和其他三組之間均有統計學差異(P<0.05)；周期開始時LH水平在四組之間無統計學差異(P>0.05)；周期開始時實驗組E2水平高于卵泡期對照組和自然周期對照組，且均有統計學差異(P<0.05)；黃體期對照組E2水平高于卵泡期對照組、自然周期對照組，且均有統計學差異(P<0.05)；周期開始時P水平黃體期對照組高于其他三組，且均有統計學差異(P<0.05)。

四組促排卵起始時的竇卵泡計數無統計學差異(P>0.05)；但自然周期對照組HCG日直徑>10 mm和直徑>14 mm的卵泡數少于其他三組，均有統計學差異(P<0.05)(表1)。

三、實驗組和對照組IVF/ICSI促排卵結局

自然周期對照組獲卵數、成熟卵數、受精卵數、卵裂數和可用胚胎數及冷凍胚胎數均低于其他三組，且有統計學差異(P<0.05)。四組間獲卵率、成熟卵率、受精卵率、卵裂率、卵子利用率之間均無統計學差異(P>0.05)。自然周期對照組周期取消率高于實驗組和卵泡期對照組，且有統計學差異(P<0.05)(表2)。

組 別周期數周期治療天數HMG用藥天數HMG日均用量(U)竇卵泡計數周期開始FSH水平(U/L)實驗組5011.8±3.99.8±3.5152.4±18.24.8±2.74.8±2.2卵泡期對照組9210.9±3.77.8±5.6#124.4±45.34.3±3.25.6±3.2黃體期對照組1912.7±5.412.7±5.4?170.7±54.44.6±3.49.9±5.4?自然周期對照組17///3.4±2.76.7±3.3組 別周期數周期開始LH水平(U/L)周期開始E2水平(pmol/L)周期開始P水平(nmol/L)HCG日直徑>10 mm卵泡數HCG日直徑>14 mm卵泡數實驗組503.1±1.9154.1±25.51.0(0.6,1.3)6.2±5.04.6±3.7卵泡期對照組924.3±3.244.5±10.5?#1.0(0.6,1.0)4.5±3.24.2±3.0黃體期對照組198.7±5.4177.3±50.913.7±7.0?4.3±3.24.1±3.0自然周期對照組174.9±3.434.5±23.4?#1.3(0.6,1.3)1.3±0.4?1.3±0.4?

注：與實驗組比較，*P<0.05；與黃體期對照組比較，#P<0.05；與其他組比較，?P<0.05

組 別周期數獲卵數成熟卵數受精卵數卵裂數Day3優質胚胎總數Day3冷凍胚胎總數形成囊胚數實驗組503.8±3.3?3.3±2.8?2.8±2.6?2.7±2.5?1.6±1.5?1.6±1.5?0(0,0)卵泡期對照組923.1±2.2?3.0±2.1?2.8±1.9?2.7±2.5?1.5±1.3?1.5±1.3?0(0,0)黃體期對照組192.9±2.2?2.4±1.7?1.9±1.2?1.8±1.1?1.0±0.3?1.0±0.3?0(0,0)自然周期對照組170.7±0.40.5±0.20.3±0.10.3±0.10.2±0.10.2±0.10(0,0)組 別周期數冷凍胚胎總數獲卵率成熟卵率受精卵率卵裂率卵子利用率周期取消率實驗組501.8±1.7?53.485.384.797.854.624.0?卵泡期對照組921.5±1.3?52.596.893.596.150.026.1?黃體期對照組191.0±0.3?54.583.678.394.439.147.4自然周期對照組170.2±0.132.466.762.580.037.582.4

注：與自然周期組比較，*P<0.05

四、實驗組促排卵過程中激素特征

FSH在誘發排卵前維持在10～20 U/L之間，LH維持在1～5 U/L之間，兩者變化相對穩定。E2水平在促排卵過程中穩定上升，在HCG次日達到最高。P水平在月經2～5天應用小劑量GnRH-a后先升高，后逐漸降低，至HCG日后再次升高(圖1)。

圖1 實驗組促排卵過程中激素特征

五、實驗組和對照組FET妊娠結局

妊娠結局統計時間截至2018年7月1日。50 例患者共形成可用胚胎248枚，包括實驗組89枚和對照組159枚。目前共解凍胚胎122枚，解凍后存活并移植122枚，包括實驗組67枚和對照組55枚。共行73個FET周期，包括實驗組42個周期和對照組33個周期，其中有兩個FET周期為各移植1枚實驗組胚胎和1枚對照組胚胎，且兩個周期移植后尿HCG均為陰性。

實驗組移植后有15例患者尿HCG為陽性，其中1例生化妊娠，14例臨床妊娠。臨床妊娠中12例宮內單胎妊娠，2例宮內雙胎妊娠。胚胎種植率23.9%(16/67)，臨床妊娠率33.3%(14/42)。14例臨床妊娠中流產5例、早產1例、足月分娩8 例。實驗組目前累積臨床妊娠率32.4%(12/37)，累積活產率24.3%(9/37)。

對照組移植后6例患者尿HCG為陽性，其中1例異位妊娠，5例臨床妊娠。臨床妊娠中3例宮內單胎妊娠，2例宮內雙胎妊娠。胚胎種植率12.7%(7/55)，臨床妊娠率15.2%(5/33)。5例臨床妊娠中流產2例，早產1例，足月分娩2例。對照組目前累積臨床妊娠率5.8%(4/69)，累積活產率2.9%(2/69).

實驗組和對照組的胚胎種植率、臨床妊娠率和繼續妊娠率無統計學差異(P>0.05)，目前累積臨床妊娠率和累積活產率間有統計學差異(P<0.05)。

討 論

對于月經周期縮短的DOR患者，部分會出現早卵泡期雌激素水平上升現象，并高于卵巢儲備功能正常的同齡婦女。Klein等[20]證明這一現象的出現是由于卵泡期的提前而非加速，上一月經周期過早出現的卵泡選擇、優勢化導致該周期優勢卵泡出現和排卵的提早發生。在正常月經周期婦女中，黃體期至卵泡期的轉化過程中FSH水平逐漸上升并達到一個小的峰值，這樣的激素水平變化和卵泡的募集、選擇有關。同時，抑制素B(Inhibin B，In B)是小卵泡分泌的蛋白類激素，可負反饋抑制FSH分泌。然而DOR患者由于卵巢儲備功能降低，在卵泡期和黃體期In B水平均低于同齡正常卵巢儲備婦女[21-22]，導致對FSH的抑制減弱，使黃體期至卵泡期轉換過程中的FSH峰提前幾天發生[23-24]。從而導致DOR患者提早發生的卵泡募集、選擇和優勢化，使月經周期縮短，甚至在月經期出現直徑10 mm以上的優勢卵泡。月經期升高的雌激素水平可抑制FSH的分泌和釋放，進而出現基礎FSH水平正常但基礎E2水平升高的狀態。這種看似平衡的狀態是暫時的，隨著卵巢功能進一步下降，基礎E2水平下降且基礎FSH水平上升，達到圍絕經期甚至絕經期水平[13]。因此大家普遍認為，對于DOR患者，基礎E2水平上升是基礎E2水平下降的前驅階段，是卵巢儲備功能下降較早的標志[15-16]。

當基礎E2水平升高時，IVF/ICSI-ET臨床結局往往受到影響。優勢卵泡提早出現、月經周期縮短是獨立于年齡等其他因素外單獨的ART不良預后指標[25]，可以導致IVF/ICSI中較高的周期取消率。Licciardi等[11]報道B-E2>110.1 pmol/L時，臨床妊娠率下降；B-E2>220.2 pmol/L時，獲卵數降低；B-E2>275.3 pmol/L時，無臨床妊娠發生。Smotrich等[12]報道B-E2≥293.6 pmol/L時，臨床妊娠率降低，周期取消率升高；B-E2≥367.0 pmol/L時，周期取消率高達33.0%且無臨床妊娠發生。Evers等[13]報道基礎FSH正常且B-E2>220.2 pmol/L時，周期取消率比B-E2≤220.2 pmol/L的患者明顯升高(56% vs.13%，P<0.05)。Frattarelli等[14]報道B-E2≥293.6 pmol/L時，周期取消率33.9%；B-E2≥367.0 pmol/L時，周期取消率26.1%。Jiang等[15]報道基礎FSH正常時，高B-E2組活產率低于低B-E2組(44.0% vs.49.2%)，且在基礎FSH升高時，結論相同(17.6% vs.30.9%)。Gürbüz等[26]發現基礎雌激素升高的婦女，習慣性流產發生率更高。當月經周期第2～4天優勢卵泡直徑≥14 mm且B-E2≥734.0 pmol/L時，可采取月經期取卵，一定程度上節約了患者時間，但仍然無法解決可用胚胎數少、周期取消率高的問題[27]。根據以往研究報道，DOR患者IVF/ICSI周期出現高基礎雌激素水平時，較高的周期取消率是難以避免和亟待解決的問題。

為解決DOR患者高基礎雌激素狀態下周期取消率高的這一難題，既往研究報道在DOR患者前次黃體期添加雌激素，可達到抑制黃體期和早卵泡期竇卵泡發育不同步的目的，使更多卵泡同步發育，誘導顆粒細胞FSH受體增加[28]。Chang等[29]對卵巢低反應患者進行研究，從前次月經第21天開始至本次月經第3天每天口服4 mg雌二醇，獲卵數、可用胚胎數均高于對照組。受到孕激素促排及黃體期促排在卵巢低儲備患者中切實有效的啟發[30]，本研究基于小劑量GnRH-a誘發后開始進行的卵巢促排卵策略，適用于早卵泡期卵泡發育不同步的狀態，無需雌激素預處理。可能由于在月經期使用小劑量GnRH-a產生flare-up作用，使已產生的優勢卵泡顆粒細胞黃素化，對外源性FSH敏感性降低，使竇卵泡有更多發育的機會。隨后聯合Gn和MPA、CC共同進行促排卵，模擬了黃體期促排卵內分泌模式但又不盡相同。本研究納入的50例DOR患者實驗組可達到和卵泡期對照組、黃體期對照組相類似的IVF/ICSI結局，可用胚胎數、周期取消率、胚胎種植率及臨床妊娠率均無統計學差異(P>0.05)。本研究中周期取消率及臨床妊娠率可達到自身非高基礎雌激素狀態下的類似水平。與以往研究相比，可能提示這種促排卵方案在一定程度上提高了臨床妊娠率、降低了周期取消率。

但本研究仍有一定的局限性：(1)該研究為回顧性研究，仍需前瞻性等更有力的研究進一步驗證及支持；(2)每組誘發排卵方式不同：自然周期對照組采用GnRH-a或HCG誘發，高孕激素狀態促排卵采用GnRH-a聯合HCG誘發。包淑婷等[31]證明對于高孕激素促排卵而言，雙扳機可提高獲卵率和優胚數。每組誘發排卵至取卵時間不同，常規取卵時間為誘發后32～36 h。Lu等[32]提出自然周期32～34 h取卵并結合E2下降水平判斷是否緊急取卵可降低提早排卵的發生率。在我中心未發表的數據中，對于高孕激素狀態下促排卵方案，誘發后36～38 h取卵的胚胎學結局可能優于34～36 h取卵，因此本研究中各促排卵方案誘發方式及取卵時間不盡相同；(3)小劑量GnRH-a的作用機制目前仍然未能完全了解，該方案適用條件范圍也仍待繼續探索；(4)盡管移植時胚胎選擇是隨機的，但兩組胚胎解凍率仍然不同，實驗組胚胎解凍率75.3%(67/89)，對照組胚胎解凍率34.6%(55/159)，兩組胚胎解凍移植率有統計學差異(P<0.05)。此外，由于DOR患者自身條件限制，50例患者中有8例從未進行過FET周期，其中原因包括無可用胚胎、仍在繼續進行取卵周期、反復內膜條件差取消移植、個人原因等等。由于多方面因素的限制，實驗組及對照組胚胎未能完全解凍，因此胚胎發育潛能及臨床妊娠結局的研究可能存在一定的局限性，仍需后續研究及觀察。但是不可否認的是，針對DOR患者高基礎雌激素狀態，小劑量GnRH-a誘發后的卵巢促排卵方案應用后并未明顯提高周期取消率，可達到和正常基礎雌激素狀態下常規促排卵相類似的結果，是一種可行的促排卵方案，為DOR患者的治療提供了一種新的IVF/ICSI思路和策略。