先天性無虹膜合并先天性白內障家系致病基因突變分析

陳 靖，朱思泉

0引言

先天性無虹膜(congenital aniridia)是一種嚴重的常染色體顯性遺傳疾病，多雙眼發病，以部分或全部虹膜缺失為其特征性臨床表現，可伴有其它眼部結構異常，包括角膜混濁、青光眼、白內障、晶狀體異位、斜視、眼球震顫等[1]。凡是肉眼可在前房周邊見到部分虹膜結構者稱為部分性無虹膜，需用房角鏡檢查才能窺見少許虹膜殘端者稱為無虹膜。無虹膜患者多數伴有晶狀體皮質、前后極或彌漫性混濁，偶爾可見晶狀體脫位或晶狀體缺損。此外，先天性無虹膜患者常因并存前房角小梁組織結構異常導致先天性或發育性青光眼[2]。因致盲性及嚴重的并發癥，先天性無虹膜成為目前有待進一步明確其致病基因的遺傳性眼部疾病之一。

先天性無虹膜在臨床上罕見，文獻報道其發病率約為1∶96000～1∶64000，其中瑞典為1∶76000，挪威為1∶70000[3]，我國發病率約為1∶100000。約2/3的病例為家族性，具有很高的外顯率，但表現度不一，有研究發現其外顯率達100%。此外，約1/3的病例為散發病例，部分散發病例常伴有全身異常，如骨骼畸形、顏面部發育不良、泌尿系統先天異常、發育遲緩及腎母細胞瘤(nephroblastoma，又稱Wilms瘤)，稱為WAGR綜合征(W指Wilms瘤；A指aniridia，即無虹膜；G指genitourinary anomalies，即泌尿生殖系統畸形；R指mental retardation，即智力發育遲緩)[4]。目前關于先天性無虹膜的基因研究已成為熱點，普遍認為人類配對盒基因(paired box gene，PAX6)是其主要致病基因。PAX6基因是一種高度保守的轉錄因子，是眼球發育的主要調控基因，并且對胰島細胞合成與分泌胰島素發揮調節作用[5]，但并非所有先天性無虹膜病例皆為該基因突變所致。本研究收集了就診于北京同仁醫院眼科門診的某先天性無虹膜合并先天性白內障家系，通過直接測序方法進行PAX6基因篩查，以尋找可能的致病突變基因位點。

表1 引物序列

外顯子正向引物(5-3)反向引物(5-3)1AGGGAACCGTGGCTCGGCGGGTGAGGGAAGTGGCTGC2TTATCTCTCACTCTCCAGCCGGAGACCTGTCTGAATATTGC3TCAGAGAGCCCATCGACGTATCTGTTTGTGGGTTTTGAGCC4AGTTCAGGCCTACCTGATGCGTCGCGAGTCCCTGTGTC5CTCCCTCATCTTCCTCTTCCGGGGTCCATAATTAGCATCG6～7GGGCTACAAATGTAATTTTAAGAAAAGAGAGGGTGGGAGGAGGTA8GAGCTGAGATGGGTGACTGGAGAGTAGGGGACAGGCAAA9AGACTACACCAGGCCCCTTTTGAAGATGTGGCATTTACTTTGA10GTACCGAGAGACTGTGCAGTTTCTGAGGGCAAGAGAAATGACAGTAG11GGGCTCGACGTAGACACAGTGGAAACTGAGGGCAAGAGAA12CGGGCTCTGACTCTCACTCTGCCACTCCTCACTTCTCTGG13GCTGTGGCTGTGTGATGTGTAGGAGATTCTGTTTGGGTA14TCCATGTCTGTTTCTCAAAGGTCAACTGTTGTGTCCCCATAG

1對象和方法

1.1對象于2014-01/2015-01收集就診于首都醫科大學附屬北京同仁醫院眼科門診的先天性無虹膜合并先天性白內障家系1個，該家系為具有明確遺傳病史的常染色體顯性遺傳家系，其中先天性無虹膜合并先天性白內障患者3例。另選取100名健康志愿者作為對照。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，并經我院倫理委員會批準，所有受檢者均知情同意。

1.2方法

1.2.1檢查方法先天性無虹膜合并先天性白內障家系成員均進行視力、角膜、前房、虹膜、晶狀體、玻璃體、視網膜、眼壓、B型超聲、裂隙燈、眼底照相、前房角(表面麻醉下)等眼科檢查，并進行全身檢查以排查是否伴有其它系統異常。

圖1先天性無虹膜家系圖圓圈表示女性，方框表示男性，實心表示患病，空心表示正常，羅馬數字表示代數，箭頭指示為先證者。

1.2.2基因檢測清晨于肘正中靜脈處采集受檢者外周靜脈血5mL。采用經典酚-氯仿提取法提取DNA，經紫外分光光度法檢測提取的DNA純度和濃度。根據美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的PAX6基因序列和參考文獻[4]設計引物，擴增區覆蓋4～13外顯子及外顯子內含子接頭處，引物序列見表1。以基因組DNA為模板，進行特異性擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶并判斷是否擴增成功。對擴增特異性好的PCR產物用蝦堿性磷酸酶(SAP)和核酸外切酶Ⅰ處理，37℃酶切40min，80℃ 5min；對擴增特異性差的PCR產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)分離PCR產物，并用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit(天根生化科技有限公司)回收特異性擴增產物。PCR擴增產物經Millipore純化板純化，對純化的產物加入BigDye(美國ABI)做測序反應，測序產物再次純化，純化產物溶解后上機，讀取基因序列信息。使用DNA star軟件、Chromas軟件對測序圖進行拼接、讀取，尋找雜合位點并使用CLC DNAWbrkbench 5.0軟件分析突變位點是否導致氨基酸改變，并與100名健康志愿者的測序結果相對比，初步判斷是否為新的且保守的突變位點。

2結果

2.1系譜分析和臨床表現本研究選取的先天性無虹膜合并先天性白內障家系共3代，連續3代成員每代均有發病，患者3例，其中女2例，男1例，患者的父母均有一方患病，子女發病的可能性為1/2，無性別差異，根據遺傳學圖譜分析，該家系呈常染色體顯性遺傳(圖1)。先證者是1名27歲女性，雙眼完全性無虹膜伴晶狀體皮質及核混濁，彩色眼底照相結果因混濁晶狀體而模糊(圖2)。3例患者均表現為完全性無虹膜，并伴有晶狀體混濁，眼部檢查無其它畸形，角膜透明，眼壓正常，無眼球震顫等。該家系成員均未合并其它系統并發癥。

2.2PAX6基因測序結果PAX6基因突變分析結果顯示，在該家系先證者(Ⅱ1)中發現一個雜合性c.991 C>T突變，位于PAX6基因外顯子11編碼區，其母親(Ⅰ2)的測序結果也發現這一雜合突變(圖3)。該基因突變是一個無義突變，使精氨酸(Arg)變為終止密碼(R331X)，使得翻譯提前終止，造成一個截短的蛋白，從而該蛋白失去功能。該家系其他正常成員與100名健康志愿者的測序結均中未發現此突變。

圖2先證者檢查結果A：右眼彌散光檢查結果；B：左眼彌散光檢查結果；C：右眼彩色眼底照相；D：左眼彩色眼底照相。

圖3PAX6基因測序圖A：先證者(Ⅱ1)測序圖；B：先證者母親(Ⅰ2)測序圖；C：健康志愿者測序圖。箭頭所示為突變位點，PAX6基因11外顯子c.991 C>T。

3討論

先天性無虹膜是由于在胚胎發育過程中神經外胚層和中胚層出現障礙，導致眼部結構發育異常，多為雙眼發病，分為部分性無虹膜和無虹膜。無虹膜者約50%～85%伴有白內障，并有進展趨勢，多伴有晶狀體板層、前后極或彌漫性混濁；由于懸韌帶的節段性缺失，還可見晶狀體脫位。另有約20%的患者可合并角膜混濁，其多繼發于角膜緣干細胞缺乏[1]。此外，約6%～75%的患者常合并青光眼，其中約91%的患者因前房角小梁組織結構異常，常需多次抗青光眼手術才能相對控制眼壓進展[6]。無虹膜者還因瞳孔極度散大，常有畏光，瞼裂變小，并由于眼部異常而引起視力減退，可并發眼球震顫、斜視等[7]。

胚胎發育過程中，PAX6基因在組織和器官的形成中發揮重要作用。PAX6基因位于第11號染色體短臂13位點(11p13)，是由14個外顯子組成的高度保守的轉錄因子，編碼由422個氨基酸組成的蛋白，包含61個氨基酸組成的同源結構域(homeodomain，HD)和128個氨基酸組成的成對結構域(paired domain，PD)，兩者間由一個79個氨基酸組成的連接體區域(link domain，LNK)分隔，其下游還有一個由79個氨基酸組成的富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的轉錄反式激活域(proline serine threoninrichdomain，PST)，可激活PAX6蛋白調控的下游基因的表達[8]。目前，PAX6基因在眼球發育中發揮的作用還未完全闡明，PAX6蛋白被認為能夠激活參與眼球、中樞神經系統及胰腺發育的相關基因。此外，PAX6蛋白亦表達于眼球各種組織中，包括視盤、視泡、晶狀體、角膜上皮、虹膜、睫狀體、神經視網膜各層以及視網膜色素上皮。對于發育中的眼球，PAX6蛋白首先在視窩中表達，其次是視泡，隨后為分化的視網膜[9]。目前已有超過400個PAX6基因的突變位點被報道[10]。PAX6基因突變多發生在外顯子5～14，突變方式多樣，分為6種突變類型，即無義突變、剪接突變、框移突變、框內缺失或插入突變、錯義突變和連綴突變。無義介導降解(nonsense-mediated decay，NMD)為先天性無虹膜最常見的突變類型，通常使包含PTCs(pre-mature termination codons，PTCs)的mRNA在翻譯成截短蛋白前降解，阻止了截短蛋白合成，PAX6基因發生突變而成為無效等位基因，致使基因單倍劑量不足，出現典型的無虹膜癥狀[11]。

臨床觀察發現，先天性無虹膜與先天性白內障可同時存在，這部分患者的白內障發病年齡較早、手術難度大、術后視力改善有限[12]，有研究認為其發病原因可能與PAX6基因突變有關[13-14]。此外，先天性白內障還可并發先天性虹膜缺損，有文獻報道該過程與16號染色體MAF基因突變有關[15]，也有學者認為其致病基因可能位于2q33染色體上[16]。另有研究觀察15例先天性白內障合并虹膜發育異常患者的臨床表型發現，其中7例核性白內障患者并發完全性虹膜缺損，2例全白內障患者并發部分完全性虹膜缺損，5例全白內障患者并發無虹膜，1例縫性白內障患者并發無虹膜，表明先天性白內障表型與虹膜發育不全有一定的規律性，但還需進一步觀察研究[17]。

本研究在先證者及該家系其他患病成員的PAX6基因11外顯子中發現一個無義突變c.991 C>T(p.331R>X)，家系中其他正常成員及家系外正常對照無該突變，提示這一突變是導致該家系先天性無虹膜合并先天性白內障的主要原因。該突變位點的發現，不僅擴展了PAX6基因的突變譜，還為先天性無虹膜合并先天性白內障家系的遺傳咨詢與產前診斷提供重要的依據，對預防患者后代中再次出現該病的發生具有一定的指導意義。