miR-132在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中的表達及其臨床意義

劉 茹，陸曉和

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最嚴重和最為常見的微血管并發(fā)癥之一。世界衛(wèi)生組織公布，DR是全世界導致視力缺損和失明的第二大原因，已成為眼底病基礎和臨床研究領域的難點和熱點，探究DR的發(fā)病機制及預防策略具有重要的臨床意義。

miRNAs可參與腫瘤形成、炎癥反應、細胞增殖和凋亡、糖尿病和心血管疾病等多種病理生理過程。miRNAs也存在于人的循環(huán)血液系統(tǒng)中，能夠從外周血檢測，而且穩(wěn)定性與重復性相對較好[1]。與mRNA不同的是，miRNAs在體液中相對穩(wěn)定，甚至能抵御RNA酶的消化作用[2-3]。這一特性使外周血miRNAs檢測有望成為惡性腫瘤及其它疾病新的非創(chuàng)傷性的標記物[4-5]。在對DR的研究中，視網(wǎng)膜組織標本很難獲得，為病理檢查和病理分析帶來很大困難，因此如果外周血miRNAs檢測能夠作為標記物應用于臨床，這對于DR患者將具有更為顯著的臨床意義[6-7]。臨床上，miRNAs在玻璃體液和房水中也可以檢測到特異性的表達[8-9]，Hirota等[8]研究表明，與新生血管化和纖維化有關的幾種miRNAs在DR患者玻璃體液中的表達明顯高于黃斑裂孔患者。這就使得miRNAs在玻璃體和房水中的表達差異可以提示某種疾病，為臨床提供一種診斷和預后的分子生物學標志。Wu等[10]在鏈霉素注射10wk后成功建立糖尿病大鼠模型，并在糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜內發(fā)現(xiàn)有11中microRNAs明顯升高，包括miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-135b、miR-592、 miR-190b、miR-363、miR-29c-5p，并且有6種MicroRNAs顯著降低，包括miR-10b、miR-10a、 miR-219-2-3p、miR-144、miR-338、miR-199a-3p。同時驚喜地發(fā)現(xiàn)，部分microRNAs在視網(wǎng)膜內表達量的變化與DR的發(fā)展一致，這就表明microRNAs調節(jié)與DR之間有某種聯(lián)系。

microRNA-132(miR-132)是馬克斯普朗克學會Lagos-Quintana等[11]2002年在小鼠神經(jīng)組織中首次發(fā)現(xiàn)的，有研究表明[12]，miR-132與胃癌的預后密切相關。最近Marler等[13]通過體外和體內實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)由miR-132與p250GAP途徑，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進小鼠胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的生長。臨床上，我們發(fā)現(xiàn)處于同一階段的糖尿病視網(wǎng)膜視神經(jīng)病變，預后可能截然不同，提示我們可能視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷程度不同，這就迫切需要一種分子生物學標志能夠提示這種凋亡。已有研究表明[14]，miR-132在DR大鼠血管內皮細胞中表達水平升高，那么在DR患者循環(huán)體液中miR-132的表達情況，目前尚不清楚。本研究通過探討miR-132在不同分期DR患者血漿中的表達變化，有助于揭示miRNA-132與DR發(fā)展的關系，以期為DR尋求新的生物標志物。

1對象和方法

1.1對象選取2015-07/10于我院內分泌科確診的55例糖尿病患者，并由眼科醫(yī)師專人行眼底散瞳檢查和熒光素血管造影(fluorescein angiography，F(xiàn)FA)檢查，所有患者抽血前均未接受過眼部治療。糖尿病診斷標準[15]：空腹血糖>7.0mmol/L或者OGTT 2h血糖>11.1mmol/L和糖化血紅蛋白>6.5%。按DR國際臨床分期標準將患者分為5組：背景期：無明顯視網(wǎng)膜病變組13例(A組)；非增殖期(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)33例，包括輕度NPDR組10例(B組)，中度NPDR組11例(C組)，重度NPDR組12例(D組)；增殖期(proliferative diabetic retinopathy，PDR)9例(E組)。另選取我院體檢健康者12例作為陰性對照組(F組)。排除標準：眼部手術史，伴有嚴重高血壓病、嚴重高血脂癥、惡性腫瘤、肺部疾病及自身免疫性疾病患者，合并其他影響糖代謝的疾病(如甲狀腺功能亢進等)，急性代謝紊亂綜合征，嚴重心腦血管疾病及外傷等。所有研究對象的年齡及是否規(guī)范控制血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本次研究經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均為自愿參加本次試驗，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集由專人收集研究對象的一般資料，包括：性別、年齡、既往史、個人史、糖尿病持續(xù)時間、血糖、糖尿病并發(fā)癥、用藥史。

1.2.2試驗方法抽取所有研究對象肘靜脈空腹全血5mL，按照Tiangen miRNA提取試劑盒進行操作提取RNA，并檢測RNA純度，miRNA-132逆轉錄應用加尾方法，U6應用普通逆轉錄方法逆轉錄通用引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG( T )24N( A，G，C)-3’。PCR下游引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；miRNA-132上游引物：5’-TAACAGTCTACAGCCATGGTCG-3’。U6上游引物： 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用SYBR Green I染料法進行熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測，PCR反應條件為：95℃預變性5min，1個循環(huán)；95℃變性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40個循環(huán)，測量miR-132和U6的相對表達量。

2結果

2.1基本資料DR各組與健康對照組在男女構成比例方面，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.049)；各組在年齡、是否規(guī)范治療方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組間糖尿病病程比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010)，糖尿病病程越長，DR越重(表1)。

2.2 PCR產物熔解曲線熔解曲線分析結果顯示熔解曲線形成單一峰，表明無非特異性產物和引物二聚體形成，引物的特異性良好(圖1)。

2.3 miR-132在各組患者血漿中的表達及與臨床資料的關系與健康對照組相比，除無明顯視網(wǎng)膜病變組外，其余各組DR患者血漿miR-132的表達水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；非增殖期各組間、非增殖期與增殖期組間比較，miR-132表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2)。本試驗收集患者年齡、性別、糖尿病病程、是否規(guī)范治療作為影響患者血漿miR-132表達的因素。對以上因素與血漿中miR-132含量的關系進行分析，結果發(fā)現(xiàn)以上因素均與血漿miR-132表達無相關性(P>0.05)。

3討論

目前，miRNAs表達量的檢測方法主要有4種：實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、miRNA芯片微陣列、分子探針技術、直接測序技術。其中qRT-PCR較其他方法特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確，更適合分析體液中得到的miRNAs。本研究中我們采用qRT-PCR方法檢測糖尿病患者血漿中miR-132的相對表達水平，且PCR熔解曲線為單一波峰，說明miR-132引物的設計和反應條件的優(yōu)化均較好，另外我們在試驗中有效地避免了RNA酶的污染，同時采用U6作為內參，提示本試驗的數(shù)據(jù)具有較高的可信度。

表1 糖尿病視網(wǎng)膜病變患者和健康對照組的臨床特征

分期例數(shù)性別(例,%)男女年齡(x±s,歲)病程(x±s,a)是否規(guī)范治療(例,%)是否背景期組135(39)8(61)55.2±3.123.9±2.74(31)9(69)輕度NPDR組104(40)6(60)56.1±5.85.8±3.77(70)3(30)中度NPDR組113(27)8(73)59.3±8.98.9±4.86(55)5(45)重度NPDR組124(33)8(67)63.1±11.812.6±5.54(33)8(67)PDR組92(22)7(78)63±16.116.2±4.63(33)6(67)健康對照組126(50)6(50)57.4±4.70-- P0.0490.3270.0100.526

圖1miR-132與U6熔解曲線A：miR-132；B：U6。

圖2miR-132在各組患者血漿中的表達A：miR-132在各組患者血漿中的表達；B：miR-132在NPDR與PDR兩組的表達。aP<0.05vs健康對照組；cP<0.05vs背景期DR。

miRNAs的自身結構比較特殊，目前應用較多的有兩種檢測方法：莖環(huán)法和加尾法，在原理上存在差異。兩種方法的反轉錄引物設計原則不同，而PCR 擴增引物的設計原則是相同的，也遵守常規(guī)PCR的引物設計原則。這兩種方法的思路不同，導致引物設計和試驗方法上的差異。二者各有優(yōu)缺點，莖環(huán)法引物設計較困難，大量檢測成本高，但其特異性、靈敏度高于加尾法；而加尾法引物設計相對簡單，操作容易。本試驗中，最初設計用莖環(huán)法，但是在預試驗中發(fā)現(xiàn)，莖環(huán)法PCR結果中，水的PCR產物中出現(xiàn)目的條帶，提示我們存在污染可能性，后改為加尾法進行miRNAs的qRT-PCR試驗。

miRNAs一般在細胞間隙內發(fā)揮生物學作用，但在人類生物體液，如血清、血漿、尿液、唾液、淚液、房水和玻璃體中也能檢測到穩(wěn)定的miRNAs[16]，體液中的miRNAs不僅是在標準狀態(tài)下穩(wěn)定，而且在經(jīng)受冷凍、pH劇烈變化、長時間放置室溫下都不會發(fā)生改變[3]，因此人們設想把它作為人類疾病病理學的分子標記來進行研究，并且在很多疾病中已經(jīng)報道了循環(huán)中的miRNAs表達譜，包括糖尿病疾病[17-19]。miR-132在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管內皮細胞中表達上調[14]，而在DR患者外周血循環(huán)中miR-132的表達情況，尚未見相關文獻報道。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-132在健康人和無明顯DR患者血漿內表達量相對較高，在非增殖期和增殖期DR患者體內miR-132表達量降低，這提示在DR發(fā)展過程中，miR-132有可能也起了保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞作用，從而阻止DR的發(fā)展，當miR-132下降時，可能提示病變進展，但隨著DR程度加重，miR-132表達量差異無統(tǒng)計學意義。而Kovacs等[14]研究表明，miR-132在DR大鼠血管內皮細胞中表達水平升高，與我們的試驗結果不一致，分析原因本次試驗檢測的是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，而Kovacs等檢測的是miR-132在DR大鼠視網(wǎng)膜血管內皮細胞中的表達情況，這可能是導致結果差異的原因；本次試驗中發(fā)現(xiàn)miR-132含量在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿內含量相對較低，導致循環(huán)熒光域值(CT值)較大，PCR結果可能存在誤差，因此后續(xù)試驗需要進一步更為精確的檢測方法。有研究表明，在DR中MAPK1/3信號通路對視網(wǎng)膜血管損傷和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的釋放有關鍵調節(jié)作用[20]。同時，MAPK3/1與DR病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關，與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡有關。而miR-132對小鼠胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的生長有促進作用[13]。那么miR-132與MAPK1/3信號通路在DR發(fā)展中的具體作用及對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用機制，我們將通過對高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進行進一步的深入研究。