甲醛緩釋體類防腐劑對活體兔鞏膜交聯有效性的研究

許寅聰，仝春梅，趙亞芳，王超英

0引言

近年全球近視人口數量迅速增長，已引起社會的廣泛關注，預測在2020年全世界有1/3的人口患有近視[1-2]。我國是高度近視高發國家，青少年高度近視患病率為6.69%～38.4%[3-5]。高度近視尤其是病理性近視因后鞏膜持續擴展，眼軸持續增長，導致眼球后部血液循環障礙，逐漸影響視網膜和脈絡膜，誘發高度近視視網膜病變[6]，如黃斑出血、黃斑裂孔、視網膜劈裂、視網膜脫離、后鞏膜葡萄腫、漆裂紋樣損害和Fuchs斑等，嚴重損害視功能[7-10]，但臨床上尚缺少控制病理性近視的有效手段。研究發現，病理性近視患者鞏膜生物力學降低[11-12]。受紫外線A-核黃素角膜交聯技術在角膜疾病中應用的啟發[13-14]，目前國內外學者積極探索通過鞏膜交聯方法增強鞏膜生物力學(如應力、應變、彈性模量等)，以達到防治鞏膜重塑，進而希望將其應用于病理性近視的治療[15-17]。本研究旨在通過研究甲醛緩釋體類防腐劑(FARs)對活體兔鞏膜交聯后的鞏膜生物力學強度的改變來衡量其有效性，篩選出對鞏膜膠原交聯效果較強的FARs藥物。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康無眼疾新西蘭白兔170只(由河北醫科大學實驗動物中心提供)，1年齡，雌雄不限，體質量1.67±0.14kg，由本院實驗動物中心飼養，室溫20℃～23℃，白天自然光照射，光照與黑暗的周期比例為12h∶12h。入組前檢查眼瞼、角膜、瞳孔等未見眼部明顯異常。本研究方案及實驗動物的使用經本院動物實驗倫理委員會批準(2018-KY-09)。

1.1.2主要試劑和儀器設備主要試劑：羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙內酰脲、惡唑烷、戊二醛均購自北京索萊寶生物科技有限公司。主要儀器設備：Instron 5544-C8024型主機及配套分析軟件、2711-006型杠桿式纖維材料彈簧夾具均來自太原理工大學生物力學研究所。

1.2方法

1.2.1 實驗動物分組及處理按照隨機數字表法將實驗動物分為17組，每組10只，其中15組為FARs藥物組(羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙內酰脲、惡唑烷)，每種藥物根據給藥濃度分為三個亞組即1/10最大允許濃度組、1/2最大允許濃度組、最大允許濃度組，另設戊二醛(陽性對照)組、空白對照組。所有動物均選擇右眼為實驗眼，左眼均未予以任何處理。FARs藥物組動物結膜下注射FARs藥物濃度見表1，注射部位分別為角膜緣后3mm Tenon囊下鼻上1∶00位、顳下7∶00位，各注射1次，每次0.25mL，每次注射間隔2d。戊二醛組動物結膜下注射50.00mmol/L的戊二醛，注射部位、劑量、頻次等同FARs藥物組?？瞻讓φ战M動物結膜下注射生理鹽水，注射部位、劑量、頻次等同FARs藥物組。

1.2.2 鞏膜生物力學參數測量

圖

1

各組動物鞏膜極限應力情況。

1.2.2.1取材給藥60d后，使用鹽酸氯胺酮注射液(35mg/kg)麻醉動物后采用空氣栓塞法處死，固定在手術臺上，常規消毒后在無菌條件下取右眼，立即清除眼球表面結膜及筋膜組織，并將眼球按照分組進行標記，依次放入眼球保存液1(含25%新生牛血清、2%DMSO、2.5%蔗糖)、眼球保存液2(含25%新生牛血清、4%DMSO、5.5%蔗糖)、眼球保存液3(含25%新生牛血清、6%DMSO、7.5%的蔗糖)中，每種保存液中浸泡10min，最后放入眼球保存液4(含25%新生牛血清、7.5%DMSO、10%蔗糖)中，密封后放入-196℃液氮中保存。運輸至力學實驗室中將離體兔眼從液氮中取出后放入37℃水浴箱中復溫，取鼻上1∶00位和顳下7∶00位角膜緣后鞏膜，制作成5mm×10mm的鞏膜條帶。

表1 FARs給藥濃度 mmol/L

1.2.2.2生物力學測試首先測量鞏膜條帶厚度，測厚儀由力學實驗室提供，測量由同一人負責完成。之后將鞏膜條帶使用2711-006型杠桿式纖維材料彈簧夾具固定，微調夾具，使鞏膜條帶松緊適度，用游標卡尺測量夾具之間鞏膜條帶的長度并記錄，使用Instron 5544-C8024型材料試驗機依次執行蠕變實驗、預拉伸實驗、拉伸強度實驗、拉伸破壞實驗程序，計算彈性模量、蠕變率、極限應力和極限應變。

2結果

2.1鞏膜厚度及生物力學參數給藥60d后，各組動物鞏膜厚度差異無統計學意義(P>0.05)，而鞏膜極限應力、極限應變、彈性模量、蠕變率差異均有統計學意義(P<0.001)，見表2。5種FARs藥物對于極限應力、極限應變、彈性模量、蠕變率均有一定的增強效應，且具有一定的藥物濃度依賴性。

2.2各組動物鞏膜極限應力情況FARs藥物組動物鞏膜極限應力均較空白對照組增大，且除咪唑烷基脲和乙內酰脲1/10最大允許濃度組以外差異均有統計學意義(P<0.05)，但FARs藥物組動物鞏膜極限應力均低于戊二醛組，差異均有統計學意義(P<0.05)。分別給予5種FARs藥物1/10最大允許濃度、1/2最大允許濃度、最大允許濃度，檢測結果顯示，羥甲基甘氨酸鈉表現出最強的交聯能力，鞏膜極限應力增強最明顯，分別為1.33±0.50、2.35±0.76、2.82±0.94MPa，分別為空白對照組動物鞏膜極限應力的2.18、3.85、4.62倍；其次，交聯能力較好的為重氮咪唑烷基脲組和惡唑烷組，最差的為咪唑烷基脲和乙內酰脲組，見圖1。

表2 各組動物鞏膜厚度及生物力學參數檢測結果

組別鞏膜厚度(mm)極限應力(MPa)極限應變(%)彈性模量(MPa)蠕變率(%)羥甲基甘氨酸鈉組 1/10最大允許濃度0.30±0.041.33±0.50a,c30.19±7.91a,c7.70±1.94a,c8.26±3.19a,c 1/2最大允許濃度0.31±0.042.35±0.76a,c24.62±4.88a,c11.06±3.56a,c4.26±1.79a,c 最大允許濃度0.30±0.042.82±0.94a,c20.27±4.51a,c14.50±3.05a3.35±1.03a,c重氮咪唑烷基脲組 1/10最大允許濃度0.29±0.071.28±0.37a,c28.04±7.45a,c7.21±1.84a,c9.12±2.51a,c 1/2最大允許濃度0.29±0.061.80±1.07a,c23.81±4.93a,c9.61±2.65a,c6.38±2.21a,c 最大允許濃度0.31±0.052.65±0.67a,c18.27±6.03a12.76±2.53a,c4.25±1.94a,c咪唑烷基脲組 1/10最大允許濃度0.29±0.041.08±0.39c31.29±7.08a,c5.66±5.58c9.80±2.41a,c 1/2最大允許濃度0.30±0.081.45±0.38a,c27.949±5.55a,c9.18±1.53a,c7.01±2.03a,c 最大允許濃度0.32±0.071.84±0.30a,c22.27±4.44a,c12.12±2.90a,c5.84±1.22a,c乙內酰脲組 1/10最大允許濃度0.31±0.061.06±0.33c32.32±6.85a,c6.17±1.78c8.75±1.61a,c 1/2最大允許濃度0.29±0.061.59±0.68a,c27.55±7.18a,c9.24±2.05a,c6.33±2.70a,c 最大允許濃度0.28±0.051.89±0.46a,c21.69±5.66a,c12.51±2.89a,c4.80±1.52a,c惡唑烷組 1/10最大允許濃度0.32±0.031.23±0.35a,c29.83±5.55a,c7.15±1.31a,c7.69±2.68a,c 1/2最大允許濃度0.29±0.061.86±0.83a,c25.61±7.17a,c10.02±4.56a,c4.74±1.96a,c 最大允許濃度0.27±0.072.34±0.64a,c19.96±4.84a,c13.76±2.63a,c3.64±1.08a,c戊二醛組0.31±0.053.63±1.61a14.15±5.49a17.28±8.08a1.22±0.72a空白對照組0.30±0.030.61±0.2738.44±4.813.60±2.8411.82±1.58 F0.6310.418.9229.60816.494P0.86<0.001<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vs戊二醛組。

2.3各組動物鞏膜極限應變情況FARs藥物組動物鞏膜極限應變均較空白對照組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，但FARs藥物組動物鞏膜極限應變均高于戊二醛組，除重氮咪唑烷基脲最大允許濃度組以外差異均有統計學意義(P<0.05)。分別給予5種FARs藥物1/10最大允許濃度、1/2最大允許濃度、最大允許濃度，檢測結果顯示，重氮咪唑烷基脲表現出最強的交聯能力，鞏膜極限應變分別為28.04%±7.45%、23.81%±4.93%、18.27%±6.03%，分別較空白對照組降低了27.05%、38.06%、52.47%；其次，交聯能力較好的為羥甲基甘氨酸鈉和惡唑烷，最差的為咪唑烷基脲和乙內酰脲，見圖2。

2.4各組動物鞏膜彈性模量情況FARs藥物組動物鞏膜彈性模量均較空白組增加，且除咪唑烷基脲和乙內酰脲1/10最大允許濃度組以外差異均有統計學意義(P<0.05)，但FARs藥物組動物鞏膜彈性模量均低于戊二醛組，且除羥甲基甘氨酸鈉最大允許濃度組以外差異均有統計學意義(P<0.05)。分別給予5種FARs藥物1/10最大允許濃度、1/2最大允許濃度、最大允許濃度，檢測結果顯示，羥甲基甘氨酸鈉表現出最強的交聯能力，鞏膜彈性模量分別為7.70±1.94、11.06±3.56、14.50±3.05MPa，分別為空白對照組動物鞏膜彈性模量的2.14、3.07、4.03倍，尤其是在最大允許濃度時幾乎與戊二醛組接近；其次交聯能力較好的為重氮咪唑烷基脲和惡唑烷，最差的為咪唑烷基脲和乙內酰脲，見圖3。

2.5各組動物鞏膜蠕變率情況FARs藥物組動物鞏膜蠕變率均較空白組顯著降低，且高于戊二醛組，差異均有統計學意義(P<0.05)。檢測結果顯示，分別給予5種FARs藥物1/10最大允許濃度，惡唑烷組動物鞏膜蠕變率最低(7.69%±2.68%)，較空白對照組降低34.94%；分別給予5種FARs藥物1/2最大允許濃度和最大允許濃度，羥甲基甘氨酸鈉組動物鞏膜蠕變率最低(4.26%±1.79%和3.35%±1.03%)，較空白對照組降低63.96%、71.66%；其次交聯能力較好的為重氮咪唑烷基脲和乙內酰脲，最差的為咪唑烷基脲，見圖4。

圖2各組動物鞏膜極限應變情況。

圖3各組動物鞏膜彈性模量情況。

圖4各組動物鞏膜蠕變率情況。

3討論

病理性近視的發病機制與鞏膜的生物力學特點和自身的缺點有關，因為從眼球壁三層結構的力學性能來看，在相同應力的作用下，從視網膜、脈絡膜到鞏膜的切線模量呈數量級遞增[18]，在近視的發展過程中，肌成纖維細胞減少和收縮力下降，鞏膜細胞外基質重塑，膠原減少，膠原分子內、分子間結構的不穩定和破壞，最終導致鞏膜生物力學改變，并引起一系列高度近視病變影響視力。既往關于病理性近視的治療方法較少，國內目前臨床應用相對廣泛的是后鞏膜加固術，手術對于高度近視黃斑裂孔、阻止眼球繼續增長具有一定效果[19]，但其加固材料尚存爭議[20]，同時長期有效性、安全性仍需進一步觀察。近年國內外學者積極探索將鞏膜膠原交聯引入病理性近視的治療中，目前研究的鞏膜膠原交聯方法分為物理交聯和化學交聯兩種，本研究是對鞏膜化學交聯藥物的探索。

FARs具備較強的交聯效應，同時具有緩釋的特點，能有效延長藥物作用時間，有可能降低藥物使用劑量，這使得其具備鞏膜交聯治療病理性近視的潛在優勢。同時，FARs是一類被廣泛應用于化妝品、個人護膚用品防腐(如皮膚修復產品、沐浴露、指甲油、洗發水、嬰幼兒無淚香波等)的化合物，約有100余種，其應用已有數十年之久，考慮到其在日常生活中使用頻率較高，且直接接觸人體，卻并未查詢到其致癌變、致畸形的報道，故認為其潛在的安全性可能較高。歐洲化妝品和非食品科學委員會對FARs的安全性進行了廣泛研究，歐盟理事會也在76/768/EC法令中詳細規定了各種FARs在化妝品行業和紡織業中可應用的濃度。本研究選擇的最大允許濃度則參考了歐盟理事會關于FARs的法令，但因FARs種類繁多，需進行實驗篩選出交聯效果強、毒性更低的種類。Babar等[21]通過測量經過FARs交聯后鞏膜的熱變性溫度和對人皮膚成纖維細胞的毒性反應認為，FARs是一類強效低毒性的交聯劑。

我們通過查閱文獻初步篩選出羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙內酰脲、惡唑烷五種較為有潛質的備選藥物。既往研究認為，戊二醛是最強的化學交聯劑，但其有較強的細胞毒性，所以一般用于工業和病理標本的固定，也常被用于交聯技術研究的陽性對照藥物[22]。此外，考慮本課題組既往已獲得較成熟的建立幼兔形覺剝奪模型的經驗，加上兔標本容易獲得，體質量容易控制，故本研究對上述5種藥物用于鞏膜交聯的有效性進行了活體兔實驗研究，未選擇其他動物。結果表明，羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙內酰脲、惡唑烷均表現出了明顯的交聯效應，增強了鞏膜生物力學的強度，在極限應力、極限應變、彈性模量、蠕變率4個方面均增強，5種藥物的增強效應均具有一定的藥物濃度依賴性。其中，羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、惡唑烷三種藥物交聯效果更強。從生物力學參數檢測結果來看，極限應力最多增大了363%(羥甲基甘氨酸鈉最大允許濃度組)，極限應變最多降低了52.47%(重氮咪唑烷基脲最大允許濃度組)，彈性模量最多增加了303%(羥甲基甘氨酸鈉最大允許濃度組)，蠕變率最多降低了71.66%(羥甲基甘氨酸鈉最大允許濃度組)。但是考慮到未來臨床使用的安全性方面，我們希望在低濃度時就能發揮出較高的交聯效果，所以重點分析在1/10最大允許濃度下5種FARs的有效性，極限應力最多增大118%(羥甲基甘氨酸鈉組)、極限應變最多降低27.05%(重氮咪唑烷基脲組)、彈性模量最多增大114%(羥甲基甘氨酸鈉組)、蠕變率最多降低34.92%(惡唑烷組)。賈冠美[23]通過紫外線A-核黃素鞏膜膠原交聯實驗發現，暴露兔鞏膜后滴0.1% 5-磷酸核黃素 5min后，用波長為370nm，功率為3.0mW/cm2的紫外線燈進行照射20min后，彈性模量增加26.31%，蠕變率降低了40.47%，極限應力增加了12.21%。Liu等[24]對豚鼠進行了紫外線A-核黃素鞏膜膠原交聯實驗，結果發現交聯能顯著增強鞏膜生物力學強度。趙亞芳[25]對兔后Tenon囊下注射京尼平發現，實驗眼和對照眼比較極限應力增加了39.27%，極限應變降低16.62%，蠕變率降低17.88%，彈性模量增加35.70%。Campbell等[26]和Levy等[27]研究證明后Tenon囊下注射京尼平能顯著增強鞏膜生物力學強度，同時電鏡下觀察其對視網膜結構未造成損傷，具有較好的安全性。Zyablitskaya等[28]研究認為后Tenon下注射40～400mmol/L(0.4mL)羥甲基甘氨酸鈉均可以引起注射部位及其周圍鞏膜的交聯效應，且具備明顯的濃度效應，400mmol/L的交聯強度是40mmol/L的6倍。上述研究結果表明，FARs具備顯著的增強鞏膜生物力學強度的能力。

本研究通過觀察活體兔后Tenon囊下注射FARs后鞏膜生物力學參數的變化表明，羥甲基甘氨酸鈉、重氮咪唑烷基脲、惡唑烷具備較強的鞏膜膠原交聯效應，能夠顯著提高后鞏膜生物力學強度，具備治療病理性近視的潛能。但FARs藥物也存在弊端，甲醛是一級致癌物，雖然目前尚無資料反應此類藥物具備致癌效應，但應該進行充分的驗來證明其安全性，本課題組也會在未來的研究中增加相應內容，如觀察視網膜功能、視神經功能、鞏膜組織及其周圍肌肉血管神經的形態和功能改變，最終選出具備臨床治療病理性近視的可行性方法或藥物，為臨床病理性近視的治療提供新的方法。