四極離子阱阱內離子解離技術的研究進展

楚士穎，謝 潔，江 游，王方軍，翟 睿，馮璐璐，龔曉云，戴新華，田 地，方 向，邱春玲，黃澤建

(1.吉林大學儀器科學與電氣工程學院，吉林 長春 130026；2.中國計量科學研究院，北京 100029；3.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023)

四極離子阱(下文簡稱“離子阱”)可以存儲離子，進行離子選擇存儲或逐出，以及多級質譜分析。在涉及物質結構分析的蛋白質組學[1-2]以及生物化學[3]等領域中，通過阱內離子解離技術得到碎片離子信息，對推斷前體離子結構具有重要作用。隨著生物化學分析對質譜提出的新需求，為克服低質量截止效應(low mass cut-off,LMCO)、豐富碎片離子種類，以及提高解離速度而開發的新型阱內離子解離技術是質譜儀器研究的熱點之一。2011年，McLuckey等[4]從氣相離子反應的角度對用于離子解離和離子轉化的各種離子相互作用(包括離子/中性、離子/光子、離子/電子和離子/離子)進行了總結。本工作將阱內離子解離技術分為依賴于背景氣體碰撞和不依賴于背景氣體碰撞兩大類，對其解離裝置、解離原理和解離操作方法進行綜述，并展望其未來的發展趨勢，為其深入研究與應用提供參考。

1 四極離子阱原理

1.1 幾何結構

Paul[5-6]于20世紀50年代發明了三維四極離子阱(quadrupole ion trap,QIT)。QIT由1個環電極和2個端蓋電極構成，環電極上施加射頻(radio-frequency,RF)電壓用于束縛離子，端蓋電極上施加低壓交流波形用于離子注入、逐出和解離，示于圖1a。1995年，美國Thermo公司的Bier等[7]提出了具有質量選擇性徑向逐出的二維線形離子阱(linear ion trap,LIT)，此想法于2002年由同公司的Schwartz等[8]實現，示于圖1b。LIT由三組長度分別為12、37、12 mm的雙曲桿組成，每組有4個平行電極，其有效離子云長為30 mm。當Thermo Finnigan LCQ Deca三維四極離子阱與LIT工作頻率相同，所束縛的離子在四極場的每個維度上具有相同的運動頻率時，LCQ Deca的離子云半徑為1.0 mm，LIT減少了空間電荷效應，空間電荷上限是LCQ Deca的18倍[9-10]。

圖1 離子阱示意圖[6] (a)和二維線形離子阱基本設計圖[8] (b)Fig.1 Schematic view of the ion trap[6] (a) and basic design of the two-dimensional linear ion trap[8] (b)

1.2 離子在離子阱中的運動規律

離子在離子阱中的運動滿足馬修微分方程：

(1)

三維四極離子阱的結構示于圖1a，依據離子在電場中的受力分析得到：

(2)

(3)

式中：u為直流電壓；ξ=Ωt/2為與時間相關的參數；Ω為離子阱捕獲射頻(RF)信號的角頻率；au，qu為無量綱的馬修參數；z0為軸向半徑；r0為徑向半徑。

離子運動主要由久期頻率(secular frequency)描述：

(4)

(5)

在離子阱中，最典型的離子激發方法是共振激發[11]。在實際應用中，由于電極失調、電極不能制造成具有完全光滑的表面或理想的雙曲截面等約束，引入了高階場[12-13]。在存在高階場的情況下，離子的長時運動頻率將隨阱中徑向振幅的變化而移動，從而使被激發的離子脫離共振。線形離子阱的工作過程與3D離子阱相似，都是以離子在四極場中的運動規律來實現質量分析，即線形離子阱x-y平面的電場與3D離子阱r-z平面的電場具有相同的性質。

2 依賴于背景氣體碰撞的解離

2.1 基于共振激發的解離技術

2.1.1常規碰撞誘導解離 離子阱中的碰撞誘導解離(collision-induced dissociation,CID)是指離子被共振激發并吸收驅動射頻電場的能量獲得動能，與阱內背景氣體發生碰撞產生產物離子的過程[11,14]。碰撞氣體既可以使高能量的離子發生碰撞冷卻，又可以經碰撞將離子的動能轉化成離子的內能。當采用氦氣作為碰撞氣體時，隨著氣體壓力的增加，碰撞冷卻的速度大于內能升高的速度，母離子內能減小，解離效率降低[15]。最常見的共振激發方法[16]是在3D離子阱z方向的端蓋或2D線形離子阱x/y電極對上施加與離子長時運動頻率相同的偶極交流信號，選擇質荷比激發離子[17]。CID的特點是具有普遍性、易于實現。最近還有研究人員基于CID開發了新的串聯質譜方法，可以同時檢測正負離子CID的產物和選擇性修飾CID[18-19]。

2.1.2脈沖Q解離 2005年Schwartz等[20]發明了脈沖Q解離(pulsed Q dissociation,PQD)。PQD的實現過程分為3步：1) 將被激發的離子放置在高qu值(0.6～0.85)處，用1個高振幅(傳統方法的5～20倍)的短脈沖(100 μs)對其進行共振激發；2) 經過短時間延遲(45～100 μs)，母離子解離；3) 在出現明顯碎片之前，RF振幅迅速降低，離子處于低qu值，實現了低質荷比離子的檢測，PQD的操作示于圖2。傳統方法捕獲碎片離子qu為0.25，低質量截止效應(LMCO)為28%；此方法捕獲碎片離子qu為0.06，LMCO為6.6%。相比于傳統方法，該方法雖然改善了低質量截止效應，但其解離效率并不理想[21-22]。PQD可用于多肽和蛋白質等生物大分子的MS/MS分析[21-26]。類似的方法還有“快速激發”碰撞誘導解離(“fast excitation” CID)[16]和高振幅短時間激發解離技術(high amplitude short time excitation,HASTE)[27]，它們都是在短時間內使用高激發振幅來激發離子。

圖2 脈沖Q解離操作圖[20]Fig.2 Pulse Q dissociation operation diagram[20]

2.1.3雙向偶極激發解離 2016年丁傳凡等[28-29]提出用于提高CID效率的離子雙向偶極激發，示于圖3。在線形離子阱中，對離子阱的每一對電極都施加1個單一的偶極交流信號，離子在x和y方向同時被激發，在相同的實驗條件下，馬修參數qu(其中u=x，y)為0.25時，該方法的解離速率常數比傳統方法高約3.8倍。與傳統方法相比，該方法可以利用較小的qu值來獲得相同的內能，從而檢測到更多的碎片離子，改善了LMCO[30]。

注：a.模擬圖；b.質子化亮氨酸腦啡肽在qu= 0.25，離子化時間為20 ms時，交流幅值與a4/b4碎片比圖3 本方法與傳統方法對比圖[29]Fig.3 Comparison of this method and conventional method[29]

2.1.4寬帶解離 存儲波形逆傅里葉變換(stored waveform inverse Fourier transform,SWIFT)通常用于離子隔離，也可以將不同振幅的多個頻率集成到1個單一的激活波形(1個寬帶波形)中用于解離[31-36]。1999年，Schwartz等[37]報道了在美國熱電公司離子阱質譜上使用的寬帶解離技術，通過固定激發頻率并緩慢掃描驅動射頻振幅，使失水產物(或落在20 Th激發范圍內的其他產物)也可以被解離，示于圖4。寬帶解離的速度較快，但在商業離子阱(如LTQ XL)上實施，其解離范圍只有20 Th。

圖4 Labetalol(m/z 329)共振與寬帶解離的原理圖[37]Fig.4 Schematic representation of labetalol (MS/MS of m/z 329) using resonance vs. wideband excitation[37]

2.1.5多代碰撞誘導解離 2016年Snyder等[38-39]提出“多代CID”的方法，示于圖5。在該方法中，交流輔助波形設置在相應的頻率上，qu值固定在1個最佳值(0.2～0.35范圍內)，當前體離子(P)的長時運動頻率與交流輔助頻率匹配時，前體離子產生碎片離子F1，隨著射頻振幅的不斷減小，一些第一代產物離子將與偶極交流場共振，產生第二代碎片離子F2，同理產生多代碎片離子。與傳統方法相比，此方法使用1個離子注入、分離和質量掃描序列即可得到卡西酮異構體和小分子(包括藥物和多肽)的結構特征，簡化了儀器，擴展了離子阱的功能。

注：P.前體離子；F1.第一代產物離子；F2.第二代產物離子圖5 多代碰撞誘導解離(寬帶激活)[39]Fig.5 Multigenerational collision-induced dissociation(wideband activation)[39]

2.2 基于非共振激發的解離技術

2.2.1紅移非共振大振幅激發 1996年Qin等[40]提出紅移非共振大振幅激發(red-shifted off-resonance large-amplitude excitation,RSORLAE)。基于MALDI串聯離子阱質譜儀[41]，用低于離子長時運動頻率的交流信號來代替與離子長時運動頻率匹配的信號，在解離之前對母離子進行高效隔離，然后射頻場的振幅在10 ms內階躍掃描，之后用較大的交流振幅(21Vp-p)進行激發，共振頻率紅移(移動5%)，示于圖6。非共振信號的作用在于：1) 比傳統共振激發擁有更高的能量沉積；2) 因為高振幅信號激發離子的質量范圍很寬，所以由于高階場導致的離子長期運動頻率的偏移會被減弱。與傳統激發方法相比，此方法使肽段的解離效率提高2.5倍。

2.2.2動態碰撞誘導解離 2007年Laskay等[42-45]提出動態碰撞誘導解離(dynamic collision-induced dissociation,DCID)。DCID采用雙頻激發波形，2個頻率相差1 kHz，在質量捕獲期間，QIT端蓋電極上施加雙頻激發波形將選定的母離子解離。該方法中，母離子擁有比傳統CID更大的內部能量，不需要共振條件和額外的掃描時間來實現母離子解離。因此，它比傳統的QIT中碰撞誘導解離方法的速度更快，是有機小分子(例如正丁基苯)和小分子合成肽(例如四-苯胺)共振激發的可行替代方案[43]，有利于自下而上的蛋白質組學分離[42]，但是這種方法使調諧相對復雜[44]。

圖6 紅移失諧大振幅激發掃描[40]Fig.6 Scan function used for red-shifted off-resonance large-amplitude excitation[40]

2.2.3高能碰撞解離 2007年Olsen等[46]提出高能碰撞解離(higher-energy collisional dissociation,HCD)。通過在LTQ XL(美國Thermo公司)質譜儀中設置1個高能碰撞室，使需要裂解的離子在碰撞室與碰撞氣體發生碰撞解離，其結構原理示于圖7。與傳統CID相比，HCD沒有低質量截止效應，提供了更多的分子結構信息[47]。HCD在亞胺離子精確定位修飾中(例如磷酸酪氨酸)具有很高的置信度[46]。

2.2.4偶極直流碰撞激活 2011年Prentice等[48-49]提出偶極直流碰撞激活(dipolar DC collisional activation,DDC)，用三維離子阱進行DDC實驗的原理示于圖8。DDC利用偶極直流電勢將整個離子云從離子阱的中心移動到射頻電場更強的區域(高階場)，不需要調諧輔助AC信號頻率與離子阱的基本長時運動頻率相匹配，可在很寬的m/z范圍內將離子解離。

圖7 Thermo的LTQ XL質譜儀原理圖[46]Fig.7 Principle diagram of LTQ XL mass spectrometer for Thermo[46]

注：虛線正弦波振蕩為應用DDC后的離子運動情況圖8 3-D離子阱進行偶極DC(DDC)實驗的示意圖[49]Fig.8 Schematic depiction of the dipolar DC (DDC) experiment with the 3-D ion trap[49]

3 不依賴于背景氣體碰撞的解離

3.1 表面誘導解離

1985年Mabud等[50]提出表面誘導解離(surface-induced dissociation,SID)。傳統SID使用兩個獨立的質量分析器，一個用于引導離子進入表面，另一個用于產物提取，大質量的碰撞表面導致高效的內能轉換，使更多的鍵斷裂，廣泛用于多肽和蛋白質等分析物[51]。1991年Cooks等[52]在單四極離子阱中實現了SID，直流脈沖使離子在徑向迅速不穩定與環電極發生碰撞獲得內能，母離子解離。SID在檢測大型復雜生物分子方面比CID更具優勢，但是該方法對產物離子的捕獲效率低，因此在QIT中SID還沒有得到廣泛的應用。

3.2 紅外多光子解離

1982年Hughes等[53]在四極離子阱中實現了紅外多光子解離(infrared multiphoton dissociation,IRMPD)，2-丙醇的質子化二聚體在80 W·cm2強度的紅外CO2激光照射50 ms可光解至25%。在離子阱中實現光解離需要兩步：一是將激光引入離子阱，目前，大多數在四極離子阱上實現紅外光引入是通過在環電極上加入1個3～6 mm的孔或者通過端蓋電極上的1個孔引入激光束；二是以用戶控制的方式觸發激光，以便在所需的掃描功能段中進行激光照射[54]。由于IRMPD與qz值無關，使其廣泛用于蛋白質解離和核苷酸測序，改善了LMCO，且易于實施。

3.3 紫外激光解離

1985年以來，Bowers等[55-56]將紫外激光器和質譜儀成功結合。紫外激光解離(ultraviolet photodissociation，UVPD)要求離子和光子同時位于同一位置，使離子能夠吸收光。通過單光子在微秒量級直接激發分子到激發態，在馳豫過程中產生分子骨架的碎裂，可以產生a、b、c、x、y、z所有理論碎片離子，由于激光脈沖的幾何特性，線形離子阱和離子回旋共振質譜儀易于改造，只需添加1個石英窗口便可將激光脈沖引入阱內[57]，其通用幾何結構示于圖9。UVPD適用于引發多肽和蛋白質中非特異性解離或高度特異性解離[57]。

圖9 四極離子阱中的紫外光解離結構圖[57]Fig.9 Ultraviolet photodissociation structure diagram in quadrupole ion trap[57]

3.4 電子轉移解離

2004年，Hunt等[58]提出電子轉移解離(electron-transfer dissociation，ETD)技術。通過離子-離子反應，在多質子化的多肽或蛋白質離子上加1個低能熱電子，使其從單電子離子變成自由基，從而誘發一系列反應并形成與CID(b、y系列離子)不同的產物離子(c、z系列離子)。ETD提供的信息可以與CID互補，從而大大提高測序的準確性，在蛋白質組學中得到了越來越廣泛的應用[59-60]。

4 總結

離子阱阱內離子解離技術對離子結構解析和串聯質譜分析具有重要作用。目前已經開發出一系列阱內離子解離技術，可以分為依賴于背景氣體和不依賴于背景氣體兩大類。使用最普遍的是CID，其效率高但仍然有一些問題亟待解決：1) 低質量截止效應；2) 碎片種類不夠豐富；3) 解離速度有待提高。研究人員針對這些問題發展了一系列阱內離子解離技術。與CID相比，紅移非共振大振幅激發、寬帶解離、動態碰撞誘導解離、雙向偶極激發和多代碰撞誘導解離技術提高了解離的速度；脈沖Q解離、雙向偶極激發和偶極直流碰撞激活技術改善了LMCO。但以上解離技術只能產生b、y系列離子，碎片離子種類沒有增加。

ETD主要發生蛋白質或者肽段的骨架碎裂，能產生c、z系列離子，豐富了碎片離子種類，但是ETD具有電荷依賴性。HCD雖然依賴于背景氣體碰撞，只能產生b、y系列離子，但它幾乎消除了LMCO，解離時間在毫秒量級，提高了解離速度，沒有電荷依賴性。董夢秋等[61]使用HCD和ETD鑒定電荷態3+、4+二硫鍵結合肽對，發現在鑒定到的1 398個肽對中，通過HCD技術可鑒定1 371對，ETD技術可鑒定412對，因此HCD碎裂效果優于ETD。

紅外多光子解離屬于慢熱型解離(slow heating dissociation)方式，一次紅外脈沖下能產生豐富的b、y系列離子，改善了LMCO，但該過程需要吸收幾十個甚至數百個光子才能引起解離，使用連續波激光在短時間內很難達到這一要求[62]，碎片離子豐度有限，對蛋白質分子上修飾位點進行精確定位較為困難。紫外激光解離(UVPD)屬于快能量解離(fast energy dissociation)方式，即使吸收單個光子也能將離子在微秒量級直接激發到激發態，不僅消除了LMCO，而且碎片離子種類較其他解離技術更豐富。研究表明，UVPD在分析蛋白質及蛋白復合物時序列覆蓋率優于CID、ETD、HCD[63]，應用于磷酸化位點定位碎片離子的數量比傳統CID平均提高了104%[64]。目前，美國熱電公司已經推出具有213 nm波長激光器的Orbitrap Fusion高分辨質譜儀，但UVPD裝置結構復雜，硬件與維護成本較高。

綜上所述，阱內離子解離技術的未來發展可以有以下兩條技術路徑：1) 發展高效的二級質譜碎裂方式，提高復雜分子的碎片離子種類及豐度，提高鑒定能力，例如更小波長UVPD；2) 多種解離技術的組合應用，獲得更全面的質譜信息，例如CID、HCD、UVPD組合運用。