QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產養殖環境沉積物中磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類抗生素

錢卓真，湯水粉，梁 焱，位紹紅，羅方方，陳 思

(1.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.海南省環境科學研究院，海南 海口 570026)

磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類抗生素是人工合成的廣譜類抗生素藥物，被廣泛應用于畜禽、水產養殖行業。據文獻[1-3]報道，近年來，抗生素使用量呈現逐年上升趨勢，在水產養殖環境中被頻繁檢出。該類抗生素進入水體環境的方式有兩種：一是通過水產養殖直接投放方式進入水體環境[4]；另一種，借由現有水產養殖常采用塘頭配套養豬或水面養鴨的養殖模式，通過畜禽糞便媒介間接進入水體環境[5]。該類藥物在沉積物中性質穩定、半衰期較長、不易降解[6-8]，可對環境造成直接污染；還可能對沉積物中微生物的耐藥性產生壓力，誘導抗生素抗性基因和耐藥性細菌的產生，從而產生嚴重的生態毒性[9-10]。此外，抗生素還可通過食物鏈蓄積作用進入人體，對人體器官產生蓄積毒性，危害人體健康。因此，近年來，抗生素的不當使用引起的環境污染和食品安全問題已成為研究熱點。

目前，用于檢測抗生素的方法有電化學法[11]、酶聯免疫吸附法[12]、高效液相色譜法[13]、高效液相色譜-串聯質譜法[14]、熒光偏振免疫分析法[15]等。其中，高效液相色譜-串聯質譜法具有準確度高、重現性好等優點，是測定抗生素殘留的主要檢測方法。與高效液相色譜-串聯質譜法結合的傳統樣品前處理方法主要是固相萃取法，但其步驟繁瑣、耗時、費用較高。雖然近幾年基于固相萃取法衍生出一系列樣品處理方法，如：磁性固相萃取法[16-17]、分子印跡固相萃取法[18-19]、多壁碳納米管固相萃取等[20-21]，但整體研究難度仍較大。2003年，Anastassiades等[22]報道了一種快速、簡單、廉價、高效、安全的樣品前處理技術，即QuEChERS方法，是全球檢測水果、蔬菜中農殘的標準樣品處理方法。該方法已廣泛應用于多種基質，如肉類、血液、酒，但將其應用于沉積物中抗生素殘留測定的研究鮮有報道。

本工作擬以水產養殖環境中的沉積物為研究對象，通過考察提取溶劑、提取方法、吸附劑組成及配比對目標抗生素回收率的影響，建立QuEChERS結合高效液相色譜-串聯質譜同時測定水產養殖環境沉積物中磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類抗生素殘留的分析方法，希望能為水產養殖環境中抗生素的有效管理和控制提供系統的理論依據和技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Ultra高效液相色譜-串聯質譜儀：美國Thermo Fisher公司產品，配有電噴霧離子源；AB204-E型、PL203型電子分析天平：德國Mettler Toledo公司產品；DT5-5型低速臺式離心機、GT16-3高速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司產品；MS3型旋渦混合器：德國IKA公司產品；KQ600DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；HSC-24B水浴氮吹儀：天津市恒奧科技發展有限公司產品；Milli-Q型超純水儀：美國Millipore公司產品；FD8-6 凍干機：金西盟(北京)儀器有限公司產品；0.22 μm尼龍微孔濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司產品。

萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺喹噁啉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、鹽酸克林霉素、克拉霉素、替米考星、泰樂菌素酒石酸鹽標準品：純度均大于98%，德國Dr Ehrenstorfer公司產品；交沙霉素標準品：純度大于99%，歐洲藥典EPCRS產品；三乙酸竹桃霉素、阿奇霉素二水合物、紅霉素和羅紅霉素標準品(純度大于95%)，吉他霉素標準品(純度大于92%)：均為德國Dr Ehrenstorfer公司產品。上述標準品均用甲醇配制成100 mg/L的標準儲備液(稱取的標準品質量按純度修正過的質量)，再用甲醇配制成1 mg/L的26種抗生素標準混合液，將所配溶液于-20 ℃下避光保存。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Tidea公司產品；乙酸銨、磷酸、二水合磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉：均為化學純，國藥集團化學試劑有限公司產品；無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18：天津博納艾杰爾科技有限公司產品；超純水：由Milli-Q型超純水儀制備；磷酸鹽緩沖液：2.72 g KH2PO4·2H2O與0.13 mL H3PO4混合，用超純水定容至100 mL。

10個沉積物樣品采自漳州的水產養殖區，包括泥質、泥沙、沙質3種類型，采樣深度0～20 cm，每個樣品約500 g。沉積物樣品經凍干機干燥24 h后研磨，過80目篩，于4 ℃冰箱內保存。其中，沉積物樣品的含水率為14.1%～47.2%，有機質含量為0.45%～2.11%。

1.2 樣品前處理

稱取(2±0.02) g試樣于50 mL塑料離心管中，加入0.15 g Na2EDTA、20 mL乙腈-磷酸鹽緩沖液(1∶1，V/V)，渦旋1 min，超聲5 min，劇烈手搖2 min，再加入2 g NaCl繼續手搖1 min，以4 000 r/min離心5 min；移取7～8 mL上清液于15 mL含0.25 g MgSO4、0.05 g C18、0.12 g PSA、0.01 g GCB的離心管中，渦旋1 min，手搖1 min，以3 000 r/min離心3 min，移取5 mL上清液，50 ℃氮吹至干。加入0.5 mL乙腈-水溶液(2∶8，V/V)，超聲溶解，過0.22 μm濾膜后，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm×5 μm)；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量20 μL；流動相：A為4 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液；洗脫程序：0～5 min(10%～90%B)，5～9 min(90%～100%B)，9～10 min(100%～10%B)，10～15 min(10%B)。

1.3.2質譜條件 電噴霧離子源，正離子檢測模式，霧化室加熱溫度220 ℃，噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力367 kPa，輔助氣流量5 mL/min，離子傳輸毛細管溫度320 ℃，多反應監測模式(MRM)。母離子、子離子和碰撞能量列于表1。Q1半峰寬0.7 u，Q3半峰寬0.7 u，碰撞氣(氬氣)壓力0.2 Pa。標準品多反應監測離子流色譜圖示于圖1。

表1 多反應監測母離子、子離子和碰撞能量Table 1 Parent ions, daughter ions and collision energy of MRM

注：*為定量碎片離子

圖1 標準品多反應監測離子流色譜圖(20 μg/L)Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard solutions (20 μg/L)

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化

大多數的QuEChERS采用乙腈、弱酸性緩沖液作為提取溶劑，實驗在參考AOAC(Association of Official Analytical Chemists)2007.01官方QuEChERS和美國 EPA 推薦方法的基礎上，考察了1%乙酸-乙腈溶液、McIlvaine緩沖液(pH 4.0)-乙腈和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 3.0)-乙腈的提取效果。結果表明：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.0)-乙腈的提取效率最高，可同時提取3種類型的目標抗生素，且平均回收率在67.2%～112%之間，示于圖2。由于抗生素與沉積物結合較緊密，單純的渦旋方式無法有效提取沉積物中的抗生素。因此，本實驗采用超聲波輔助提取法[23]，利用超聲波的空化、機械及熱效應等來增強提取溶液分子的運動速度及穿透力，從而提高目標抗生素的提取效率。實驗考察了1、2、5、7 min超聲提取時間對目標抗生素的提取效果。結果表明，隨著超聲提取時間的延長，目標抗生素提取效率隨之增大。當超聲時間增至5 min時，目標抗生素的平均回收率趨于穩定；當超聲時間延長至7 min時，目標抗生素的回收率無明顯變化。為了保證提取效率，同時減少雜質干擾，最終選擇5 min作為超聲提取時間。另外，實驗中還加入了NaCl，有助于分離提取液的乙腈層和水層。

2.2 凈化條件的優化

沉積物樣品中存在脂肪、色素、甾醇等雜質，要達到既能有效除去沉積物中雜質，又不會吸附目標物的目的，關鍵是吸附劑的選擇。常見的QuEChERS吸附材料有MgSO4、PSA、C18、GCB等。作為傳統的干燥劑，MgSO4用于去除有機溶劑殘留的水，吸水放熱過程可促進目標物的溶出[24]，且無水 MgSO4粒度較小，在振搖和渦旋過程中與樣品的混合更加充分，并能與乙腈發生協同作用從而提高提取效率。PSA含有2個氨基，可有效吸附糖類、色素、脂肪酸和其他極性有機酸[25-27]，且PSA屬于正相吸附劑，樣品含水量越少凈化效果越好，因此必須協調無水 MgSO4用量才能發揮較好的凈化效果。C18含有十八烷基官能團，屬于非極性吸附劑，可以吸附脂肪和一些礦物質[28]。GCB保留特殊的層狀結構，能夠吸附色素、甾醇等雜質[29]，但GCB容易吸附平面結構化合物，因此必須嚴控其用量。為了選擇合適的吸附劑，實驗考察了MgSO4(1.00、0.75、0.50、0.25 g)，PSA(0.20、0.15、0.12、0.10 g)，C18(0.15、0.10、0.05、0 g)，GCB(0.04、0.02、0.01、0 g)4 種吸附劑的不同用量對目標抗生素回收率的影響，結果分別示于圖3。實驗還考察了單種吸附劑和多種吸附劑共同凈化下，目標抗生素回收率的變化，結果示于圖4。

圖2 不同提取溶劑對抗生素回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of the different extraction solvents on the recoveries of antibiotics (n=3)

實驗結果表明：添加濃度為25 μg/kg水平時，采用單種吸附劑MgSO4、PSA、C18、GCB的凈化效果不佳，因此選用MgSO4、PSA、C18、GCB混合吸附劑凈化。隨著PSA和C18用量的增加，回收率先升高后降低；隨著MgSO4用量的增加，回收率急劇降低；在保證回收率(60%～120%)的基礎上，加入少量GCB可有效去除提取液中的色素。綜合考慮凈化效果和方法回收率，最終確定0.25 g MgSO4、0.12 g PSA、0.05 g C18、0.01 g GCB作為混合凈化吸附劑。

2.3 基質效應

應用液相色譜-質譜測定復雜基質樣品時，基質共提物對目標物的離子化具有基質增強或基質抑制效應，從而影響目標物的定量測定。基質效應(matrix effects, ME)計算公式示于式(1)：

ME=(Sm-Sx)/Sx×100%

(1)

式中，Sm和Sx分別表示基質標準溶液曲線和溶劑標準溶液曲線的斜率。當ME<-50%或ME>50%，表示存在較強的基質抑制或增強效應；當-50%≤ME<-20%或50%≥ME>20%，表示存在中等的基質抑制或增強效應；當-20%≤ME≤20%，表示存在較弱的基質抑制或增強效應。

在最佳提取凈化條件下，有13種目標物存在中等強度的基質效應，另外13種目標物存在較弱的基質效應，結果示于圖5。這說明本實驗優化的QuEChERS方法可有效消除沉積物中復雜的基質干擾物。

2.4 標準曲線、線性范圍和定量限

為了消除基質效應帶來的定量偏差[30]，采用基質匹配標準曲線法定量。移取適量的混合標準溶液，用空白沉積物樣品提取液分別配制成不同質量濃度的基質標準溶液，目標物濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、50、100、200 μg/L。以各組分濃度與其色譜峰面積進行線性回歸，結果呈良好的線性關系，相關系數均大于0.99。以10倍信噪比(S/N)計算定量限(limit of quantitation, LOQ)，具體數值列于表2。

2.5 方法準確度和精密度

以實際采集的養殖區泥質為研究對象進行標準添加實驗，分別以低、中、高3個添加水平進行加標回收實驗，每個濃度水平做6次平行實驗，考察方法的準確度及精密度。結果表明：平均回收率在60.4%～113%，相對標準偏差為1.5%～13.6%。30天內，在25 μg/kg加標濃度下進行6次標準添加實驗，考察方法的日間精密度，相對標準偏差為3.8%～11.5%，結果列于表2。該方法的精密度和準確度均能滿足藥物殘留檢測的需求。

注：a.PSA；b.C18；c.MgSO4；d.GCB圖3 不同吸附劑加入量對抗生素回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different mass of adsorbent on average recoveries of antibiotics (n=3)

圖4 單種凈化吸附劑與混合凈化吸附劑的回收率對比(n=3)Fig.4 Comparison of recoveries of single purification adsorbent and mixed purification adsorbent (n=3)

圖5 優化的凈化條件下，抗生素的基質效應Fig.5 Matrix effects of antibiotics under optimum purification conditions

以泥質、泥沙、沙質3種類型的沉積物為研究對象，在25 μg/kg加標濃度下考察方法的適用性，回收率為63.2%～111%，相對標準偏差為4.5%～11.7%，結果列于表3。

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對某養殖區的20個養殖池塘沉積物進行檢測，結果列于表4。結果表明，所有沉積物樣品中均能檢出一定量的抗生素藥物。其中，磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素均有檢出，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑的檢出率較高，這與文獻[1-5]的結果一致。磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑作為準用獸藥，其使用頻次較高、使用量也較大；它們可強吸附于沉積物上，難以降解，能夠長時間穩定殘留在沉積物基質中。

表2 線性方程、相關系數、定量限、平均回收率和日間精密度Table 2 Linear equations, correlation coefficents (R2), LODs, average recoveries and inter-day precisions

表3 不同類型沉積物樣品的加標回收率的精密度(n=5)Table 3 Recoveries and precisions of different types of samples (n=5)

續表3

表4 水產養殖區沉積物樣品中抗生素殘留量Table 4 Residue of antibiotics in sediment samples from the aquaculture area

注：ND表示未檢出或低于定量限

3 結論

通過優化QuEChERS方法的提取溶劑、提取方式、提取時間和凈化材料，實現了基于高效液相色譜-串聯質譜法高通量快速定性定量分析水產養殖環境沉積物中典型抗生素殘留。該方法簡單、快速，精密度、準確度和定量限均能滿足沉積物中獸藥殘留的分析要求。同時可為養殖環境中藥物的快速篩查平臺奠定基礎，為解決水產養殖行業生態防控、治理提供技術支持，有利于促進生態養殖、無公害養殖的持續發展。