基于UHPLC-MS/MS分析痕量芥子氣染毒血樣中血紅蛋白加合物

陳 博，于惠蘭，劉石磊，劉昌財，梁龍輝，楊 旸，吳姬娜，李曉森

(1.國民核生化防護國家重點實驗室，北京 102205；2.防化研究院分析化學實驗室，北京 102205)

芥子氣，即2，2’-二氯乙基硫醚，是一種很強的糜爛性毒劑，會引起炎癥、糜爛等癥狀[1]。芥子氣在一戰中被作為化學武器使用，在之后的兩伊戰爭、中東沖突仍引起大量的傷亡[2-3]。二戰后，日本在中國境內遺棄的化學武器含有大量的芥子氣[4]，時至今日，由芥子氣引起的人員傷亡事件仍時有發生。因此，芥子氣暴露后的溯源性分析十分必要。

芥子氣進入人體后，可以形成芥子氣-蛋白加合物、芥子氣-DNA加合物等大分子加合物，這些生物標志物可以在人體內存在數月[5-8]。研究發現[5,9]，芥子氣-血紅蛋白加合物(HD-HGB)是比較穩定的芥子氣染毒生物標志物，可在人體內存在120天左右。HD-HGB的檢測方法有兩種：一種是通過Edman降解得到N-纈氨酸加合物(HETE-Val)[10-14]，即使用酸性丙酮從血紅蛋白中分離出珠蛋白，溶于甲酰胺之后與異硫氰酸五氟苯酯(PFPITC)發生Edman降解，使用甲苯萃取得到HETE-Val，經水洗、吹干、復溶后，使用七氟丁酸酐(HFBA)或七氟丁酰咪唑(HFBI)進行衍生，隨后再次使用甲苯萃取，經水洗、干燥、吹干、復溶之后，使用氣相色譜-負化學電離源-質譜(GC-NCI-MS)檢測。該方法可獲得較低的檢出限(約3 μg/L(20 nmol/L))[11]，但操作復雜。另一種方法是使用酸水解對HD-HGB進行處理得到芥子氣-組氨酸加合物(HETE-His)，經芴甲氧羰基氯(Fmoc-Cl)衍生，采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)分析[15]，該方法條件苛刻，需要使用110 ℃高溫和濃鹽酸，且酸水解后的樣品需用大量的堿進行中和，以達到衍生反應所需的pH值。該方法基于一個離子對進行檢測，檢出限較高(1.5 mg/L)，不能滿足痕量芥子氣暴露染毒的定量分析要求。

本研究擬采用離心法分離芥子氣染毒人全血中的血紅細胞，去離子水漲裂釋放血紅蛋白，酸性丙酮去除血紅素后得到珠蛋白，經鏈霉蛋白酶酶解，固相萃取柱純化，芐氧羰基氯(Cbz-Cl)衍生，超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)痕量溯源分析芥子氣染毒全血，希望為化學武器核查分析和中毒救治等提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 6460 TripleQuad 液相色譜-質譜儀(配有電噴霧電離源)、Masshunter Qualitative Analysis B.05.00數據處理系統、固相萃取柱(Bond Elut-PPL：200 mg，3 mL；Bond Elut-NH2：200 mg，3 mL；Bond Elut-PlexaPAX：60 mg，3 mL；Bond Elut-ENV：100 mg，3 mL)、Zorbax Eclipse Plus C18預柱、Zorbax Eclipse Plus C18反相色譜柱：均為美國Agilent公司產品；Qasis HLB(3 mL)固相萃取柱：美國Waters公司產品；Eppendorf 5424臺式離心機、Eppendorf移液槍(0.1～2.5 μL、20～200 μL、100～1 000 μL)、Eppendorf 5350振蕩加熱器：均為德國Eppendorf公司產品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇(LC/MS級)、異丙醇(LC級)、水(LC/MS級)：美國Honeywell Burdick & Jackson公司產品；丙酮(LC級)：韓國Duksan公司產品；乙腈(LC/MS級)：美國Fisher Chemical公司產品；碳酸氫銨(98%)、氯甲酸芐酯(純度>95%)、甲酸(純度>98%，LC/MS級)：北京J&K Scientific公司產品；氯化鈉(99.9%)、發煙鹽酸(37%)：美國Merck Millipore公司產品；鏈霉蛋白酶(貨號：25551122)：德國Roche公司產品；芥子氣及其模擬劑2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)：由本實驗室合成；未經芥子氣暴露的健康人全血樣品：由志愿者提供。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Zorbax Eclipse Plus C18預柱(12.5 mm×2.1 mm×1.8 μm)、Zorbax Eclipse Plus C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫條件：0～2 min(5%B)，2～2.5 min(5%～10%B)，2.5～6.5 min(10%B)，6.5～7 min(10%～22.5%B)，7～12 min(22.5%B)，12～12.1 min(22.5%～100%B)，12.1～16 min(100%B)；后運行3 min；流速0.3 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2質譜條件 ESI正離子模式檢測；毛細管電壓4.0 kV；氣體溫度350 ℃；干燥氣：氮氣，流速10 L/min；霧化氣：氮氣，壓力2.4×105Pa；掃描方式：多反應監測模式(MRM)；分辨率：單位分辨。經Cbz-Cl衍生后的HETE-His(HETE-His-Cbz)和經衍生后的乙基硫乙基-組氨酸(ETE-His-Cbz)的質譜參數列于表1。

1.4 注意事項

芥子氣是一種非常活潑的糜爛性毒劑，在處理芥子氣溶液以及芥子氣染毒全血時，需要專業人員在通風櫥中進行操作。任何與芥子氣直接接觸的器具均需要使用漂白液進行徹底消毒。

1.5 標準曲線溶液及質量控制樣品的配制

使用異丙醇對10.0 g/L芥子氣乙腈溶液進行梯度稀釋，得到100、70.0、30.0、20.0、10.0、5.00、3.00、1.00 mg/L一系列芥子氣標準溶液。將20.0 μL上述芥子氣標準溶液分別添加至2.00 mL空白血漿中，于37 ℃振蕩12 h，得到8個標準曲線溶液樣品的芥子氣濃度分別為10.0、30.0、50.0、100、200、300、700、1 000 μg/L。使用空白全血對1.00 mg/L芥子氣染毒全血進行梯度稀釋，得到染毒濃度為20.0、80.0、500 μg/L的低、中、高質量控制(QCL、QCM、QCH)染毒血漿。將20.0 μL異丙醇加至2.00 mL空白血漿中作為空白樣品。標準曲線樣品、質量控制樣品以及空白樣品均置于4 ℃冰箱保存。

表1 目標物的質譜參數優化結果Table 1 Optimal parameters of mass spectrometry for analytes

注：*表示以產物離子及其前體離子為定量離子對

1.6 內標溶液的制備

將20.0 μL 2.00 mg/L 2-CEES的異丙醇溶液加入到2.00 mL血紅蛋白溶液(130 g/L)中，于37 ℃振蕩12 h，制備成內標溶液，于4 ℃冰箱保存。

1.7 樣品制備

1.7.1珠蛋白提取 采用Bailey等[16-17]報道的方法對珠蛋白進行富集。首先，取100 μL染毒全血，以1 500 r/min離心10.0 min，棄去上層血漿，分離出紅細胞，用300 μL 0.9%生理鹽水清洗紅細胞2次。然后，加入100 μL去離子水，劇烈振蕩后靜置10 min，以漲裂紅細胞，釋放血紅蛋白，以10 000 r/min離心10 min去除細胞膜。再加入10 μL內標溶液、1.0 mL 0.12 mol/L鹽酸丙酮溶液，以分離血紅素與珠蛋白，棄去上層紅色溶液，分別使用1.0 mL 0.12 mol/L鹽酸丙酮溶液、丙酮、乙醚清洗下層沉淀。將得到的珠蛋白置于室溫自然晾干，并使用400 μL 50 mmol/L NH4HCO3水溶液懸浮。

1.7.2鏈霉蛋白酶酶解與固相萃取 在上述珠蛋白懸浮液中，加入100 μL 15 g/L鏈霉蛋白酶，在700 r/min振蕩下，于55 ℃保溫10 h。酶解后，加入1.0 mL乙腈，振蕩混勻，以13 000 r/min離心5.0 min。取上清液，真空離心濃縮至約200 μL，使用去離子水定容至500 μL。

分別用3.0 mL甲醇和3.0 mL水預先平衡PPL固相萃取柱，將上述酶解液加入平衡好的PPL柱上，先用1.0 mL 5%甲醇水溶液淋洗3次，再用1.0 mL 50%甲醇水溶液洗脫目標物。洗脫液真空濃縮至約50 μL，用去離子水定容至100 μL。

1.7.3Cbz-Cl衍生 將上述濃縮后的洗脫液置于冰水浴中冷卻5 min，加入5.0 μL 1 mol/L NH4HCO3溶液，隨后加入2 μL Cbz-Cl，并立即置于4 ℃劇烈振蕩30 min。衍生結束后，加入1.0 μL 20%甲酸水溶液終止反應。將得到的衍生化氨基酸加合物轉移至自動進樣小瓶中，待UHPLC-MS/MS分析。樣品制備操作步驟示于圖1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

分別使用10 g/L芥子氣溶液與2-CEES溶液對血紅蛋白溶液進行染毒，經樣品制備后得待測液，在正、負離子模式下全掃描，選擇合適的電離方式和MRM母離子。結果表明，在ESI+模式下，HETE-His-Cbz與ETE-His-Cbz均可獲得豐度較高的[M+H]+準分子離子峰，故分別選擇m/z394、378作為HETE-His-Cbz、ETE-His-Cbz的母離子。由于組氨酸的側鏈有兩個加合位點，因此[M+H]+準分子離子峰可能有2種結構(芥子氣對應N1-HETE-His-Cbz與N3-HETE-His-Cbz，2-CEES對應N1-ETE-His-Cbz與N3-ETE-His-Cbz)。

采用子離子掃描進行二級質譜分析，對子離子進行篩選。在扣除背景后，HETE-His-Cbz有2個豐度較大的子離子，分別為m/z105、61，其中m/z105的峰面積大于m/z61，故選擇m/z394>105為定量離子對，m/z394>61為定性離子對。ETE-His-Cbz僅有1個豐度較大的子離子m/z89，將其作為內標定量離子。同時對碎裂電壓和碰撞能量等條件進行了優化，結果列于表1。

圖1 芥子氣暴露染毒樣品制備與分析流程圖Fig.1 Preparation and analysis flow diagram of HD exposed samples

圖2 酶解溫度(a)與酶解時間(b)對產物峰面積的影響Fig.2 Effects of digestion temperature (a) and digestion time (b) on peak area of target object

2.2 鏈霉蛋白酶酶解

鏈霉蛋白酶在pH 8左右時的酶解效率較高，但提取后的珠蛋白在pH 8的酶解液中溶解性較差，酶解體系為懸浮液。因此，酶解過程中需對體系進行振蕩，以確保酶解體系的均一性。為提高鏈霉蛋白酶酶解珠蛋白產生HETE-His的效率，采用1 000 μg/L芥子氣染毒的血紅蛋白溶液(130 g/L)優化酶解溫度、酶解時間和酶的濃度等參數。酶解溫度(37、45、50、55、60、70 ℃)和酶解時間(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 h)對產物峰面積的影響示于圖2。對不同濃度、不同批次的鏈霉蛋白酶進行考察，結果表明，3.00 g/L鏈霉蛋白酶就可以進行高效酶解，不同批次的鏈霉蛋白酶對酶解效率無明顯影響(±5%)。因此，最終選擇酶解溫度55 ℃，酶解時間10.0 h。

2.3 固相萃取條件的優化

在芥子氣染毒生物醫學樣品的分析中，SPE可以有效去除基質干擾，提高液相色譜-質譜的分析靈敏度[11,18]。本研究使用固相萃取柱對經酶解后的1 000 μg/L芥子氣染毒血紅蛋白溶液(130 μg/L)體系進行純化。考察了2種強度不同的陰離子交換柱(PAX，NH2)與3種非極性固相萃取柱(HLB，ENV，PPL)的純化效果。結果表明，PPL柱保留目標物、去除雜質的效果較好，結果示于圖3，圖中縱坐標為經SPE純化后目標物的峰面積。該固相萃取柱的固定相為官能化苯乙烯-二乙烯基苯，對非極性化合物的保留具有較好效果。通過對淋洗、洗脫條件進行優化，最終確定最佳的淋洗條件為3.0 mL 5%甲醇水溶液(V/V)，最佳洗脫條件為1.0 mL 50%甲醇水溶液(V/V)。

2.4 Cbz-Cl衍生

由于HETE-His的質譜響應較差，按照文獻報道[15]，使用Fmoc-Cl對HETE-His進行衍生。結果表明， Fmoc-Cl衍生后的HETE-His質譜響應仍較差，不能滿足痕量芥子氣染毒樣品的溯源性分析要求。因此，嘗試使用Cbz-Cl對HETE-His進行衍生，以提高質譜響應，結果示于圖4。

圖3 5種固相萃取柱優化結果Fig.3 Optimized results of 5 kinds of SPE column

圖4 100 mg/L芥子氣染毒血紅蛋白中未經衍生(a)，經Cbz-Cl衍生(b)和經Fmoc-Cl衍生(c)后的MRM色譜圖Fig.4 UHPLC-MS/MS MRM chromatograms of 100 mg/L HD-spiked hemoglobin solution after underivatization (a), Cbz-Cl derivatization (b) and Fmoc-Cl derivatization (c)

2.5 2-CEES染毒血紅蛋白溶液作為內標

使用芥子氣模擬劑2-CEES染毒血漿作為內標，對芥子氣-白蛋白加合物酶解后產生的HETE-CPF進行檢測，可得到較好的定量結果[19]。本研究使用2-CEES染毒的血紅蛋白作為內標，將其加入血紅蛋白溶液中，與血紅蛋白的組氨酸側鏈發生反應，生成乙基硫乙基-血紅蛋白加合物。乙基硫乙基-血紅蛋白加合物經提取、酶解、衍生后，生成ETE-His-Cbz。ETE-His-Cbz的主要碎片離子m/z89為乙基硫乙基離子([ETE]+)形成的硫鎓離子，對應HETE-His-Cbz的主要碎片離子m/z105為羥乙基硫乙基離子([HETE]+)形成的硫鎓離子。另外，HETE-His-Cbz的碎片離子m/z61為[HETE]+的羥乙基以乙烯醇的形式斷裂丟失后形成的碎片，ETE-His-Cbz的碎片離子m/z61為[ETE]+的乙基以乙烯的形式斷裂丟失后形成的碎片，HETE-His-Cbz與ETE-His-Cbz的產物離子質譜圖示于圖5。上述結果表明，二者具有相似的質譜碎裂途徑。因此，2-CEES染毒的血紅蛋白可以作為芥子氣-血紅蛋白加合物定量檢測的內標。

圖5 HETE-His-Cbz(a)與ETE-His-Cbz(b)的產物離子質譜圖Fig.5 Mass spectra of product ion for HETE-His-Cbz (a) and ETE-His-Cbz (b)

2.6 專一性考察

通過分析來自20個不同的未經芥子氣暴露染毒的人空白全血樣品，發現在HETE-His-Cbz保留時間的±0.1 min之內，m/z394>105和m/z394>61這兩個離子對均不存在背景干擾。通過測定目標物的兩個離子對峰面積比值(CIR，即定性離子對峰面積/定量離子對峰面積)對方法的專一性進行考察。結果表明，所有芥子氣染毒全血樣品的CIR范圍在(15.0±2.4)%之間，表明本方法具有很好的專一性。

2.7 線性曲線與檢出限

通過分析8個加入內標的標準曲線溶液，表明在芥子氣染毒濃度10.0～1 000 μg/L范圍內，HETE-His-Cbz/ETE-His-Cbz峰面積比具有良好的線性關系，平均標準曲線的線性方程為y=0.52x-1.47，相關系數R2>0.997。對線性范圍以外的高濃度樣品進行分析，發現目標物峰面積的增長速度減緩。根據定性離子對的信噪比確定本方法的檢出限為10.0 μg/L(信噪比≈5)，結果示于圖6，比Edman降解法的檢出限(20 nmol/L，約3.2 μg/L)略高，且Edman降解法的線性范圍略寬(0.1～120 μmol/L，約15.9～1 908 μg/L，R2>0.99)[11]。

注：a.m/z 394>61；b.m/z 394>105圖6 10.0 μg/L HD染毒與空白全血樣品中HETE-His-Cbz加合物的色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of HETE-His-Cbz from 10.0 μg/L HD-spiked blood sample and blank sample

2.8 準確度與精密度考察

本實驗分析了質量控制樣品與標準曲線的日內、日間精密度和準確度，結果列于表2。日內的準確度范圍是90.2%～105%，精密度≤10.3%；基于兩周完成了9次分析運行數據，日間的準確度范圍是89.8%～113%，精密度≤12.4%，能夠滿足準確度與精密度的相關要求[20]。

表2 方法的準確度與精密度Table 2 Accuracy and precision of this method

注：濃度均為芥子氣染毒濃度

2.9 穩定性考察

將QCL、QCM、QCH全血樣品等分3份，分別儲存于4 ℃、室溫以及37 ℃，一周后進行處理和分析，發現目標物在所有溫度下放置一周的穩定性良好，測得的目標物誤差為±15%。

將QCL、QCM、QCH全血樣品在-20 ℃與4 ℃之間反復凍融10次，分析檢測后，沒有發現目標物，可能是全血樣品反復凍融容易導致紅細胞破裂發生溶血現象，使用生理鹽水清洗紅細胞時，導致血紅蛋白損失。繼續考察凍融次數對目標物的響應產生的影響，發現凍融1次后，僅在QCH中檢測到目標化合物，且目標物峰面積與QCL初始響應相當。因此使用該方法分析檢測全血樣品時，需避免樣品的反復凍融。

將QCL、QCM、QCH全血樣品經樣品制備后，對目標物在進樣基質中的穩定性進行考察，發現目標物在所有溫度下反復凍融后放置一周仍是穩定的，誤差在±15%內，示于圖7。

圖7 穩定性考察Fig.7 Stability of this method

3 結論

本研究建立了一種高靈敏度溯源性定性、定量檢測人全血中HD染毒血紅蛋白加合物的方法。通過提取珠蛋白、鏈霉蛋白酶酶解、PPL柱純化，將芥子氣-血紅蛋白加合物轉化為HETE-His-Cbz，采用UHPLC-MS/MS進行分析檢測。該方法僅需在55 ℃下保溫10.0 h即可實現HD-HGB的完全水解，條件溫和、操作簡單，且檢出限比傳統酸解法降低大約150倍。通過考察20個空白的人全血樣品，表明在目標物保留時間±0.1 min內無背景與基質干擾。對該方法的線性范圍、檢出限、準確度與精密度和穩定性進行考察，結果均能滿足食品藥品監督管理局生物分析方法驗證指南[20]，適用于臨床樣本的分析。