高效液相色譜法測定乙酰烏頭堿片含量及含量均勻度

解瑞輝，郭社民，申利平

（1.河南省濮陽市食品藥品檢驗檢測中心，河南 濮陽 457000； 2.河南省濮陽市食品監督所，河南 濮陽 457000）

乙酰烏頭堿片曾用名3-乙酰烏頭堿片、新烏寧通片，適用于各類止痛[1-3]，主要成分為 20- 乙基 -l，6，1 6-三甲基氧基 -4-（甲氧基甲基）烏頭烷 -3，8，13，14，15-五醇-3，8-二醋酸醋-14-苯甲酸酯，系由毛蓖科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘中分離提取有效成分加工制成的片劑。乙酰烏頭堿片現行標準采用紫外可見分光光度法（UV）測定其含量[4]。國內有2家企業生產乙酰烏頭堿片，規格均為0.3 mg，重量差異不能真正反映藥品的均勻性。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定乙酰烏頭堿片的含量，同時增加含量均勻度的測定?，F報道如下。

1 儀器與試藥

Waters2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），包括Empower3化學工作站和2489UV／vis檢測器；Secomam UVIKON xL型雙光束掃描紫外／可見分光光度計（法國賽克曼公司）；Mettler Toledo XS205EU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。乙酰烏頭堿（阿拉丁工業公司，美國 CAS NO.77181-26-1，LOT.E1508001，含量為98%）；乙酰烏頭堿片（市售，北京某廠家，批號為20180403；陜西某廠家，批號分別為170801，171101；規格均為0.3 mg）；甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇、無水三氯甲烷均為分析純，碳酸氫銨（優級純），水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersBridgeC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%碳酸氫銨溶液 -乙腈 （60 ∶40，V∶V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：232 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。外標法峰面積定量。

2.2 溶液制備

稱取乙酰烏頭堿15.32 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶，加無水氯仿5 mL，超聲溶解，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取貯備液5 mL，置50 mL容量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按處方制備工藝制得不含乙酰烏頭堿的陰性對照品溶液。取本品20片，精密稱定，研細，稱取適量（約相當于乙酰烏頭堿1.5 mg），置50 mL容量瓶，加無水氯仿5 mL超聲溶解，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

干擾試驗：分別精密量取陰性對照品溶液、對照溶液、供試品溶液各20 μL，進樣測定，記錄色譜圖。結果其他成分對乙酰烏頭堿的分析無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密量取2.2項下對照品貯備液2，3，5，10，15，20 mL，分別置 100 mL 容量瓶中，加 70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取溶液各20 μL，進樣測定，記錄色譜圖。以進樣質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝4 030.2X-1 520.4，r＝0.999 8（n＝6）。結果乙酰烏頭堿進樣質量濃度在 6.0 ～60.2 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2項下同一對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次。結果乙酰烏頭堿峰面積的RSD為0.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下同一批（批號為170801）供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h 時分別精密量取20 μL注入色譜儀測定，記錄色譜圖。結果乙酰烏頭堿峰面積的RSD為0.79%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為170801）供試品，按2.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按擬訂色譜條件進樣測定。結果的RSD為0.93%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的供試品細粉（批號為 170801，含量為每片 0.2973mg），精密稱定，共 9 份，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入對照品貯備液4，5，6 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，依法進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 乙酰烏頭堿加樣回收試驗結果（n＝9）

2.4 樣品含量及含量均勻度測定

含量測定：取3批供試品，按2.2項下方法制備供試品溶液，每批平行3份，照擬訂色譜條件測定，按外標法以峰面積計算含量。結果見表2。

表2 供試品含量及含量均勻度測定結果

含量均勻度測定：分別取3批供試品各10片，研細，分別置10 mL容量瓶中，加無水氯仿1 mL超聲溶解，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。照擬訂色譜條件測定，按外標法以峰面積計算每片的標示量，按2015年版《中國藥典（四部）》通則 0941[5]含量均勻度檢查法，計算A＋2.2S。結果見表 2。

3 討論

曾試用不同比例甲醇-水、甲醇-碳酸氫銨溶液、甲醇-磷酸二氫鉀溶液等作為流動相進行試驗，但均不理想。參考文獻[6]，以碳酸氫銨溶液-乙腈為流動相，峰形對稱性符合要求，乙酰烏頭堿峰的理論板數高，與三氯甲烷的峰分離度較好。

國內2家藥品生產企業生產乙酰烏頭堿片，規格均為 0.3 mg。按《中國藥典（四部）》要求片劑、硬膠囊劑、顆粒劑或散劑等每一單劑標示量均小于25 mg，建議檢查含量均勻度[5]，增強制劑學對藥物的質量控制。

乙酰烏頭堿易溶于三氯甲烷，幾乎不溶于乙醇，不溶于水。故用無水三氯甲烷溶解，試驗過程中溶劑中的三氯甲烷對乙酰烏頭堿的分離有影響；曾嘗試揮干三氯甲烷但重復性較差，試驗過程應選擇適宜的色譜柱。