降糖類中成藥和保健食品中13種非法添加成分檢測方法改進

黎 雋 ，裴小龍 ，張 麗，王一欣

（1.陜西省醫療器械質量監督檢驗院，陜西 西安 712046； 2.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710061）

目前，市場上很多降糖中成藥和保健食品常會非法添加一些常用降糖類西藥[1]。原國家食品藥品監督管理總局頒布的降糖類中成藥和保健食品高效液相色譜檢測法（批準件編號分別為 2009029，2011008，2013001）中測定13種非法添加成分需要采用2種方法，不僅耗時長（2種方法共耗時近120 min），且流動相離子對試劑的配制十分復雜（庚烷磺酸鈉0.505 6 g，加三乙胺1.4 mL，加水至 1 000 mL，用磷酸調節 pH 至 3.5 ±0.05），成本也很高。本研究中通過改變流動相的成分，在不影響檢驗效果的情況下縮短檢驗時間至35 min，提高了檢測效率，節約了檢測成本。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent Infinity 1290型高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器。

試藥：鹽酸二甲雙胍對照品（批號為100664-200602），鹽酸苯乙雙胍對照品（批號為 100922-201001），格列吡嗪對照品（批號為 100281-200602），格列齊特對照品（批號為100269-200603），馬來酸羅格列酮對照品（批號為100952-200701），鹽酸吡格列酮對照品（批號100634-200401），格列本脲對照品（批號為 100135-200404），格列美脲對照品（批號為100674-201102），格列喹酮對照品（批號為100280-201002），瑞格列奈對照品（批號為 100753-201102），格列波脲對照品（批號為520026-201401），均購自中國食品藥品檢定研究院；樣品為市場監督抽驗降壓類中成藥及保健食品；鹽酸丁二胍對照品（批號為1-RLJ-70-1，加拿大TRC公司）；甲苯磺丁脲對照品（批號為SZBAOBXV，德國Fluka公司）；乙腈、乙酸銨（色譜純，美國Fisher公司）；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：235 nm，210 nm～400 nm；柱溫：35℃；流動相：乙腈（A）-0.02 mol／L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫程序見表 1；流速：0.2mL ／min；檢測波長：235nm；進樣量：2μL。

2.1.2 質譜條件

高效液相色譜儀：LCMS-8040；色譜柱：Zorbax SB-C18柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流速：0.2mL／min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；離子源：電噴霧離子源；電離模式：ESI＋（正離子模式）；流動相：甲醇（A）-0.01 mol／L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫程序見表 2。

表1 高效液相色譜流動相梯度洗脫程序表

表2 質譜流動相梯度洗脫程序表

2.2 溶液制備

陽性對照品溶液：稱取13種對照品各10 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質量濃度約為1 g／L的單標貯備液。臨用時，吸取不同體積各單標貯備液置同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質量濃度為50 μg／mL的混標貯備液。詳見表3。取上述13種單標貯備液各2.0 mL，置同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質量濃度分別為106.10，106.20，109.10，67.12，110.50，97.84，100.40，99.12，89.20，103.80，96.96，166.50，99.84 μg ／mL 的加標用混標貯備液。

表3 陽性對照品溶液

供試品溶液：取市場監督抽驗的降壓類中成藥及保健食品作為供試品，每份取10粒（取膠囊內容物進行測定），混勻，精密稱取相當于1次的服用劑量，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放至室溫再稱定質量，用甲醇補足減失的質量。搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照品溶液：由于降糖類中成藥和保健品制劑配方的多樣性，本試驗中采用的陰性樣品為膠囊劑，選取歷次監督抽檢中有代表性的，經過質譜驗證確認未添加化合物的中成藥或保健品。

2.3 方法學考察

干擾試驗：分別取2.2項下混標貯備液的10倍稀釋液、陰性對照品溶液注入色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在對照品溶液相應位置無干擾峰，說明本試驗條件下陰性樣品中的其他成分對測定無干擾。色譜圖見圖1。）

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察與檢出限測定：分別精密吸取0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，6.0，8.0 mL 混標貯備液置 10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得系列混合標準曲線溶液。在擬訂色譜條件下，以對照品溶液質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。以對應質量濃度的色譜峰峰高大于3倍信噪比的質量濃度乘以進樣體積（2 μL）得本方法的檢出限。結果見表4。

精密度試驗：將混標貯備液連續進樣6次。結果鹽酸二甲雙胍、鹽酸丁二胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、格列齊特、格列波脲、馬來酸羅格列酮、格列本脲、鹽酸吡格列酮、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮峰面積的RSD分別為 3.76% ，1.71% ，3.18% ，0.92%，0.87%，0.99%，1.22%，1.95%，1.93%，1.16%，0.90%，1.06%和 0.77% （n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取混合對照品溶液，室溫放置，分別于1，2，4，8 h時進樣測定。結果峰面積的RSD均在1.0% ～4.0%范圍內，表明加標樣品溶液在8 h內穩定。

加樣回收試驗：稱取4份同一陰性樣品（編號1～4），每份 0.5 g，置 25 mL容量瓶中，分別加入不同體積（0.5，1.0，2.0，3.0 mL）的加標用混標貯備液，加甲醇適量，超聲提取30 min，放至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取續濾液，過濾（0.45 μm 濾膜），即為加標樣品待測液。每份待測液平行測定2次，按外標法計算回收率。結果見表5。

表5 加樣回收試驗結果（n＝8）

2.4 供試品測定

取供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進行測定，在不同供試品溶液色譜中，出現與對照品溶液色譜保留時間相應的色譜峰。采用二極管陣列檢測器比較相應色譜峰的紫外-可見吸收光譜，取吸收光譜與對照品溶液相同的供試品溶液，按2.1.2項下色譜條件進行檢驗，離子駐留時間均為20 ms，13種非法添加成分離子碎片信息見表6，質譜圖見圖2。結果表明，高效液相色譜法檢測呈陽性的供試品，均經質譜確認含有待測非法添加成分。

表6 13種非法添加成分的離子碎片信息及相關電壓參數

3 討論

原方法中使用甲醇和離子對試劑作為流動相，雖可使各化合物得到很好的分離，但要分兩步進行，每一步都要使用不同的流動相和洗脫程序，檢驗過程煩瑣。考慮到非極性固定相，當溶劑極性增加時，待分離組分的保留值增加，分離度增大，利用這個原理改進方法，采用乙腈代替甲醇作為流動相A，延長了非離子型化合物的保留時間，從而達到了將其與離子型化合物（胍類）進行分離的目的。原方法中使用了離子對試劑（庚烷磺酸鈉、三乙胺、磷酸水溶液）抑制溶質離子化，通過調整離子型化合物解離程度來調整其極性，最終達到調整其保留值、分離度的目的[2-4]，但離子對試劑成本較高，僅適用于離子型化合物的分離。考慮到低濃度的乙酸銨（0.005 ～0.01 mol／L）可提高離子化效率，且對 11 種降糖藥物有很好的分離效果，而高濃度時（0.02 ～0.03mol／L）則產生離子抑制效應，改變溶質極性、抑制峰形拖尾[5]，因此改進方法采用0.02 mol／L乙酸銨代替離子對試液，通過調整流動相的比例改善分離效果。

圖2 質譜圖

綜上所述，本研究中對降糖類中成藥的高效液相色譜法流動相組分進行改進，不但能同時檢測13種非法添加成分，且檢測范圍寬，檢出限低，回收率高，線性關系良好，檢測時間短，操作簡單，費用低廉，可用于大批量市場監督抽樣檢品非法添加物的快速篩查。