氧氟沙星膠囊微生物限度檢查方法的建立*

曹寒梅 ，蔡 虎 ，楊曉莉 ，常 春 ，傅 強 △

（1.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061； 2.陜西浩瀚管理技術咨詢有限公司，陜西 西安 710065；3.陜西省醫療器械質量監督檢驗院，陜西 咸陽 712046； 4.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

氧氟沙星為第3代喹諾酮類抗菌藥物，對需氧革蘭陰性桿菌、腸桿菌科、假單胞菌屬、支原體、衣原體、非典型分枝桿菌等均有良好的抗菌活性，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性最強。對氧氟沙星膠囊進行微生物限度檢查時，需要消除樣品的抑菌活性，真實地反映其微生物污染情況，防止出現假陰性檢查結果。本研究中依照2015年版《中國藥典（四部）》[1]進行方法適用性試驗，利用氯化鎂與喹諾酮類抗菌藥物的絡合作用及聚山梨酯80的中和作用，通過薄膜過濾法，在稀釋劑、沖洗液、培養基中添加氯化鎂及聚山梨酯80消除抑菌活性，建立氧氟沙星膠囊的微生物限度和控制菌大腸埃希菌的檢查方法[2-3]。現報道如下。

1 材料

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus sub-tilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，大 腸 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，均購自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株均為第3代。

儀器：LDZX-30KBS型壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；XY500JC型電子天平（常州市幸運電子設備有限公司）；HFsafe-1800TEⅡB2型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；BSD-TX345型臺式恒溫振蕩器（上海博訊實業有限公司）；HH-系列電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；LRH-250F型生化培養箱、MJ 250FI型霉菌培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；FC752型薄膜過濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司，批號為20160102）。

試藥：氧氟沙星膠囊（某制藥公司，批號為150801，規格為每粒0.1 g）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為151107）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為150824）、胰酪大豆胨液體培養基（批號為151114）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號為1505252）、蛋白胨培養基（批號為160119）、麥康凱液體培養基（批號為 150911）、麥康凱瓊脂培養基（批號為1504162），均購自北京三藥科技開發公司；氯化鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，批號為20160601）；氯化鎂（天津市百世化工有限公司，批號為20150103）。

2 方法與結果[1，4-6]

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養物分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中，35℃培養24 h；將白色念珠菌的新鮮培養物接種于沙氏葡萄糖液體培養基中，25℃培養3 d。上述培養物用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉的新鮮培養物接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，25℃培養7 d或直至獲得豐富的孢子，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液體培養基至100 mL，45℃恒溫振蕩15 min，制成1∶10(m/V)的供試液 A。取供試品10 g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液體培養基至90 mL，再加入10 mL 1 mol/L的氯化鎂溶液，45℃恒溫振蕩15 min，制成1∶10(m/V)的供試液B。

2.3 微生物計數方法適用性試驗

需氧菌總數計數方法：采用薄膜過濾法。試驗組，取2.2項下供試液A、供試液B各1 mL，置含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的薄膜過濾器中，濾過，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液分別試驗沖洗5次、8次，每次100 mL。在最后一次沖洗液中分別加入菌落數不超過100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌液各1 mL。制備好的濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上。供試品對照組，取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作。菌液對照組，取不含中和劑的相應稀釋液替代供試液，按試驗組方法操作。中和劑對照組，取相應量稀釋液替代供試品，同試驗組方法操作。各組每株菌平行制備2皿，30～35℃培養2～3 d。計算平均菌落數，結果見表1和表2。

霉菌和酵母菌總數計數方法：采用平皿法。試驗組，取2.2項下供試液A分裝于2個無菌試管中，每管裝量9.9 mL，再分別加入制備好的含菌量不大于104cfu/mL的白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液各0.1 mL。取制備好的試驗組樣品液1 mL，置直徑為90 mm的無菌平皿中，注入溫度不超過45℃熔化的沙氏葡萄糖瓊脂培養基約20 mL，混勻，凝固，每株菌平行制備2皿，20～25℃培養3～5 d。同法測定供試品對照組、菌液對照組及中和劑對照組，并計算各組的平均菌落數。結果見表3。

表1 需氧菌總數計數方法的回收結果

表2 需氧菌總數計數方法回收結果

表3 霉菌和酵母菌總數計數方法的回收結果

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗[7-9]

試驗組：取供試液A 10 mL，加入含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的濾器中，混勻，薄膜過濾，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液分別沖洗3次、5次、8次，每次100 mL。濾完，取出濾膜，接種至300 mL胰酪大豆胨液體培養基中，各接入1 mL含菌量不大于100 cfu的大腸埃希菌菌液，混勻，35℃培養18 h。同法取供試液A 10 mL，加入含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的濾器中，混勻薄膜過濾，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次100 mL。濾完，取出濾膜，接入至90 mL胰酪大豆胨液體培養基中，再加入10 mL 1 mol/L的氯化鎂溶液，接入1 mL含菌量不大于100 cfu的大腸埃希菌菌液，混勻，35℃培養18 h。取上述各培養物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養基，42℃培養24 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，35℃培養18 h。陰性對照試驗：以稀釋液代替供試液，照相應控制菌檢查方法檢查。結果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法不同培養基不同體積的結果

由表1至表3可見，含5%聚山梨酯80或/和含有氯化鎂的中和劑對照組的回收比值在0.5～2.0范圍內，說明5%聚山梨酯80或/和含有0.1 mol/L氯化鎂的中和劑對試驗菌株無毒害作用。由表1及表2可見，氧氟沙星膠囊對細菌的抑制作用很強，采用含聚山梨酯80的中和劑，沖洗800 mL時，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收比值均小于0.5，不能消除氧氟沙星膠囊對3種細菌的抑制作用，當在含聚山梨酯80稀釋液中再添加氯化鎂時，沖洗800 mL，可使金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均大于0.9，表明可采用該方法作為需要菌總數的計數方法。由表3可見，氧氟沙星膠囊對白色念珠菌和黑曲霉的抑制作用較弱，可采用含5%聚山梨酯80中和劑的常規法（1 mL/皿，10-1）作為霉菌和酵母菌總數的計數方法。由表4可見，當沖洗量為800mL且加大培養基體積為300 mL時，亦無法消除氧氟沙星膠囊對大腸埃希菌的抑制作用。當沖洗量為300 mL時，濾過后，將膜接入含10 mL 1 mol/L氯化鎂的胰酪大豆胨液體培養基100 mL，即可檢出陽性試驗菌大腸埃希菌，且陰性對照試驗無菌生長。說明該方法可作為控制菌大腸埃希菌的檢查方法。

3 討論

氧氟沙星膠囊對霉菌和酵母菌抑制作用較弱，因此霉菌和酵母菌總數采用常規平皿法即可。在預試驗中，需氧菌以常規法試驗，供試液稀釋到1∶100（m/V）時，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的回收比值皆為0。由此可見，氧氟沙星膠囊對細菌有很強的抑菌活性，遂在薄膜過濾法過程中采用了最后一次沖洗時加入試驗菌的方法，并取制備的1∶10供試液1 mL或10 mL加入含100 mL沖洗液濾器中，混勻后過濾，可有效防止藥物顆粒堵塞薄膜。在中和劑的選擇上，第一，氧氟沙星膠囊有較強的抑菌活性，首選添加聚山梨酯80，因為一定濃度的聚山梨酯80能促進膠囊劑的乳化與分散，并對抑菌活性有中和作用；第二，氧氟沙星膠囊為喹諾酮類抗菌藥物，可與金屬離子（Ca2+，Mg2+，Fe3+，Al3+）發生絡合反應，使抗菌活性下降。試驗中選擇1%1 mol/L氯化鎂和5%聚山梨酯80作為中和劑加入供試液中及1%聚山梨酯80加入沖洗液中。結果表明，在制備供試液中添加一定量的氯化鎂并采用薄膜過濾法，對需氧菌的抑菌活性有明顯的減弱作用，且在控制菌大腸埃希菌檢查的方法適用性試驗組中，增大培養基體積和增加沖洗都不如在增菌培養基中直接添加氯化鎂消除抑菌效力作用明顯。在日后的探索中，可以嘗試將金屬離子中和劑直接添加至瓊脂培養基中，探索效果是否更佳，且可探索消除該類產品抑菌活性的金屬離子的最低有效濃度[10-11]。