高效液相色譜法同時測定氨咖愈敏溶液中4種成分含量

梁愛仙，龐發根，劉 敏，李玉蘭

（廣東省深圳市藥品檢驗研究院·廣東省深圳市藥品質量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057）

氨咖愈敏溶液為抗感冒類復方制劑，主要含對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚和馬來酸氯苯那敏4種成分，用于減輕由感冒（包括流行性感冒）引起的發熱、頭痛、咽痛、鼻塞、流涕、咳嗽、咳痰等癥狀[1]?，F行國家藥品標準[2-3]中4種成分均采用高效液相色譜（HPLC）法測定含量，其中對乙酰氨基酚、咖啡因和愈創木酚甘油醚3種成分在同一流動相體系下測定，而馬來酸氯苯那敏會在溶液中解離為馬來酸和氯苯那敏[4]，由于氯苯那敏極性很小，在C18柱上保留較強，易形成拖尾峰，故在另一洗脫能力較強的流動相體系下測定。為了提高檢測效率[5]，節約成本，本研究中建立了同時測定氨咖愈敏溶液中上述4種成分含量的HPLC法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括高壓四元泵，在線脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器、LCsolution工作站）；XS205DU型電子天平、MP220型pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；Millipore Q純水器（德國默克公司）。

1.2 試藥

對乙酰氨基酚對照品（批號100018-201610，含量為99.9%）、咖啡因對照品（批號171215-201211，含量為99.9%）、馬來酸氯苯那敏對照品（批號100047-201507，含量為99.7%）、愈創木酚甘油醚對照品（批號100528-201303，含量為99.6%），均購于中國食品藥品檢定研究院；氨咖愈敏溶液（批號分別為151105，160205，160407，規格為每1mL含對乙酰氨基酚12.0mg，無水咖啡因1.875 mg，愈創木酚甘油醚3.750 mg和馬來酸氯苯那敏0.112 5 mg）購于北京九龍制藥有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

圖1 高效液相色譜圖

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸三乙胺緩沖液（取三乙胺3.0 mL，加水至1 000 mL，用磷酸調 pH 至 2.6）-乙腈（85 ∶15，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：264 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別稱取對乙酰氨基酚對照品約12 mg，咖啡因對照品約9.5 mg，愈創木酚甘油醚對照品約9.5 mg，馬來酸氯苯那敏對照品約11 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，作對照品貯備液，臨用前用流動相稀釋成含對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚和馬來酸氯苯那敏質量濃度分別約為 120，19，38，22 μg/mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密量取氨咖愈敏溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，濾過，作供試品溶液Ⅰ（用于測定馬來酸氯苯那敏，約相當于22.4 μg/mL），精密量取續濾液5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋并定容，作供試品溶液Ⅱ（用于測定對乙酰氨基酚、咖啡因和愈創木酚甘油醚，分別約相當于120.00，18.75，37.50 μg/mL）。

陰性對照溶液：按處方組成，取處方中不含4種主成分的輔料成分，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下3種溶液，按2.1項下色譜條件進樣，色譜圖見圖1。結果所建立的方法對該4種成分分離良好，分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之間，理論板數均大于5 000。

線性關系考察：將對照品貯備液稀釋成系列對照品溶液，照上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以待測成分峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性方程和范圍試驗結果（n=7）

精密度試驗：取混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚、馬來酸氯苯那敏峰面積的RSD分別為 0.51%，0.60%，0.44%，1.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液（批號151105），分別于室溫下放置 0，6，12，18，24 h 時按擬訂色譜條件進樣。結果對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚、馬來酸氯苯那敏峰面積的RSD分別為1.23%，0.96%，1.21%，1.33%（n=5），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號151105）6份，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件進樣，測定峰面積，代入對應的線性方程計算。結果對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚、馬來酸氯苯那敏含量平均值分別為12.43，1.823，3.782，0.01099g/L，RSD分別為 1.21%，0.81%，1.43%，1.50%（n=6），表明方法重復性良好[6]374-378。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品（批號151105）2.5 mL，共 9份，置25 mL容量瓶中，分3組，分別精密加入對乙酰氨基酚對照品、咖啡因對照品、愈創木酚甘油醚對照品和0.11 g/L的馬來酸氯苯那敏對照品溶液（取1.1 g/L的馬來酸氯苯那敏對照品貯備液10.00 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋定容，即得），按供試品溶液制備方法制備成低、中、高質量濃度的溶液。按擬訂色譜條件進樣分析，測定4種成分的峰面積，計算回收率。結果見表2。

2.4 樣品含量測定

取不同批號的樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，外標法計算供試品溶液中對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚和氯苯那敏含量，并與現行標準[2]比較。結果見表3。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）

3 討論

氨咖愈敏溶液中，馬來酸氯苯那敏的含量低，不到對乙酰氨基酚含量的1%，故這2種成分不適合在同一供試品溶液中測定[7]。故本研究中分別配制2種不同質量濃度的供試品溶液。經全波長掃描，發現在混合對照品溶液中，對乙酰氨基酚、咖啡因、愈創木酚甘油醚和氯苯那敏分別在245，272，274，264 nm波長處有最大吸收?？紤]到氨咖愈敏溶液中對乙酰氨基酚、咖啡因和愈創木酚甘油醚的含量較高，且最大吸收峰均較寬，在264 nm波長處仍有較強吸收，故本研究中選擇氨咖愈敏溶液中含量最低的氯苯那敏的最大吸收波長264 nm作為檢測波長[8]。

表3 樣品含量測定結果（g/L，n=3）

本研究中建立的流動相體系能較好地分離該4種成分。溶劑色譜峰和輔料色譜峰均能與最先出峰的對乙酰氨基酚色譜峰分離[9]318-319，不干擾測定；最后出峰的氯苯那敏色譜峰[9]62-63在約32 min時出峰，質量濃度線性范圍內峰形均較好，質量濃度約為22 μg/mL時，拖尾因子為1.04，符合要求[6]59-61；高質量濃度（大于 100 μg/mL）略有拖尾，拖尾因子為 1.15。

3批樣品含量測定結果與現行標準方法的結果相近。本研究中在同一種流動相體系下同時測定氨咖愈敏溶液中4種成分，方法比現行標準更簡便、快速。