腺病毒介導的RNA干擾ERCC1基因表達對逆轉卵巢癌順鉑耐藥的效果

田麗娜，徐福強，姬力群，劉小平，單 育，楊菲菲，陳 靜，瞿全新

卵巢癌是嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，化療是治療卵巢癌的重要方法，但由于腫瘤細胞對化療藥物易產生耐藥性，因而影響化療效果，導致卵巢癌的總體五年生存率始終徘徊在30%[1]。化療耐藥的產生，尤其是鉑類藥物的耐藥是困擾卵巢癌治療的重要難題之一。核苷酸切除修復(NER)是順鉑耐藥的重要機制，而ERCC1基因是NER途徑的重要因素，在順鉑耐藥機制中發揮重要作用[2,3]。本實驗通過重組腺病毒方法干擾ERCC1的表達，初步探討其在體外逆轉卵巢癌細胞對順鉑耐藥的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 人類卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDP，中高分化，購于北京市腫瘤醫院藥物研究所。

1.1.2 相關試劑 注射用順鉑(凍干型)：齊魯制藥廠(批號為H20023461)。重組腺病毒Ad-hTERT-ERCCl-siRNA及只包含ERCC1啟動子的空載體腺病毒：Ad-hTERT由本研究小組前期合成[4]。RPMI-1640培養液、小牛血清與前期實驗相同[5]。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養等方法 細胞培養、藥物配置、臺盼藍排斥試驗、MTT法測定SKOV3/DDP細胞順鉑IC50值、MTT法測定腺病毒對SKOV3/DDP細胞的影響、MTT法測定腺病毒對SKOV3細胞順鉑IC50值的影響與前期實驗相同[5]。

1.2.2 細胞凋亡的形態學觀察 取對數生長期SKOV3/DDP細胞，以1×105/ml濃度每孔500 μl接種于24孔板內，培養24 h后，分別用0、80 MOI的重組腺病毒感染細胞，分為2組。培養4 h后，其中一組細胞加入順鉑，調整終濃度為10 μg/ml，培養24 h后，按照Hoechst試劑盒方法固定染色[5]，熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復3遍。

1.2.3 流式細胞技術測定順鉑及腺病毒作用的細胞周期與凋亡 將生長良好的SKOV3/DDP細胞，以1.6×105/ml濃度6 ml傳代至新培養瓶中，共11瓶，培養24 h后，加入治療藥物，分組方法為：(1)重組腺病毒組，添加重組腺病毒MOI 0、MOI 1、MOI 10、MOI 50、MOI 80；(2)重組腺病毒聯合順鉑組，在(1)的基礎上添加終濃度為10 μg/ml的順鉑；(3)空載體腺病毒聯合順鉑組，在順鉑終濃度為10 μg/ml的基礎上添加空載體病毒：MOI 50。以上各組細胞培養24 h后終止，收集細胞處理后，按流式細胞試劑盒操作方法，測定細胞凋亡和周期分布[5]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，生長曲線圖采用折線圖方法繪制，回歸方程及IC50采用回歸分析計算，均數比較采用單因素方差分析。順鉑濃度與抑制率關系及腺病毒濃度與細胞對順鉑的敏感性關系采用相關分析。

2 結 果

2.1 SKOV3/DDP細胞生長情況 SKOV3/DDP細胞生長良好，對數生長期細胞生長曲線及形態見圖1。

圖1 SKOV3/DDP細胞生長曲線及形態

A.對數生長期細胞生長曲線;B.SKOV3/DDP細胞對數生長期形態(×400)

2.2 順鉑和腺病毒對SKOV3/DDP細胞的影響 SKOV3/DDP細胞給予順鉑處理后，隨著順鉑濃度的增加，SKOV3/DDP細胞的存活數量進行性下降，細胞抑制率逐漸升高，順鉑濃度與SKOV3/DDP細胞抑制率呈線性正相關(圖2A)，相關系數r=0.9862 (P<0.05)，順鉑IC50為(13.93±0.37)μg/ml，耐藥指數為1.79。而SKOV3/DDP細胞給予不同腺病毒處理后，空載體腺病毒組中SKOV3/DDP細胞的存活數量無明顯改變。而重組腺病毒組中，隨著MOI的逐漸增加，SKOV3/DDP細胞的存活數量逐漸減少，細胞抑制率逐漸升高(圖2B)，兩組間具有統計學差異(P<0.05)。

圖2 順鉑和腺病毒對SKOV3/DDP細胞的影響

A.順鉑對SKOV3/DDP細胞的抑制率;B.不同腺病毒對SKOV3/DDP細胞的抑制率

2.3 腺病毒對SKOV3/DDP細胞順鉑敏感性的影響 空載體腺病毒組中SKOV3/DDP細胞IC50無明顯變化(圖3A)，對順鉑的敏感性無明顯改變(圖3B)。重組腺病毒組中SKOV3/DDP細胞IC50進行性下降，并且呈濃度相關性(r=0.9786，P<0.05)，兩組間結果具有統計學差異(圖3A)，MOI 80時耐藥指數為1.19。SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性隨病毒濃度的增加而增加，分別增加了11.1%(t=9.757，P<0.05)、16.7%(t=15.07，P<0.05)、26.4%(t=22.183，P<0.05)、33.5%(t=24.921，P<0.05) ，并呈濃度相關性(r=0.9716，P<0.05) (圖3B)。

圖3 腺病毒對SKOV3/DDP細胞順鉑敏感性的影響

A.感染病毒后SKOV3/DDP細胞順鉑的IC50變化；B.感染病毒后SKOV3/DDP細胞對順鉑敏感性的變化

2.4 細胞凋亡的形態學觀察 經Hoechst染色后，熒光顯微鏡下觀察，正常細胞呈藍色。細胞發生凋亡時，染色質固縮，胞核致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色略發白。正常SKOV3/DDP僅偶見凋亡細胞核(圖4A)，順鉑組可見一些細胞凋亡現象(圖4B)，重組腺病毒處理組SKOV3/DDP細胞凋亡較正常組增多(圖4C)，順鉑聯合腺病毒干預后，SKOV3/DDP細胞活力下降，細胞形態皺縮，邊緣不整，并出現凋亡小體，此為細胞凋亡的特征，凋亡細胞明顯增多(圖4D)。

圖4 SKOV3/DDP細胞凋亡的形態學觀察

A.正常SKOV3/DDP細胞; B.DDP 10μg/ml; C.重組腺病毒MOI 80; D.DDP 10μg/ml+重組腺病毒MOI 80

2.5 細胞凋亡和細胞周期測定 本實驗測得SKOV3/DDP細胞G1、S和G2/M期細胞分別為56.56%、32.62%和10.82%，凋亡率為28.13%(圖5 A-D)。

SKOV3/DDP細胞不同MOI的重組腺病毒感染后，細胞周期左移，G1期比例稍有減少(圖5A)，S期比例有所增加(圖5B)，細胞凋亡率有所增高 (圖5D)，無統計學差異(P>0.05)。

與SKOV3/DDP細胞相比，單純順鉑作用的SKOV3/DDP細胞，G1期細胞比例減少 (圖5A), S期細胞比例增高 (圖5B)，G2/M期比例有所增加 (圖5C)，凋亡率增高(圖5，D)，結果具有統計學差異(P<0.05)。

重組腺病毒聯合順鉑作用下，SKOV3/DDP細胞的Gl期比例增加 (圖5A)，S期比例一定程度增加 (圖5B)，G2/M期比例明顯減少 (圖5C)，細胞凋亡率進一步增加 (圖5D)，與單純順鉑作用組相比具有統計學差異(P<0.05)。而空載體病毒聯合順鉑作用下SKOV3/DDP細胞，與單獨順鉑治療組相比，細胞周期分布相近，細胞凋亡率無明顯改變(圖5E)，結果無統計學差異(P>0.05)。

圖5 流式細胞技術測定順鉑及腺病毒作用的細胞周期與凋亡結果

A.不同處理后SKOV3/DDP細胞G1期的比率;B.不同處理后SKOV3/DDP細胞S期的比率; C.不同處理后SKOV3/DDP細胞G2/M期的比率; D.不同處理后SKOV3/DDP細胞凋亡率;E.不同處理后SKOV3/DDP細胞周期比率及凋亡率

3 討 論

卵巢癌是嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，化療是治療卵巢癌的重要方法，但由于腫瘤細胞對化療藥物易產生耐藥性，目前已知，NER是順鉑耐藥的重要機制之一，而ERCC1是NER途徑的重要因素，在順鉑耐藥中起著重要作用[6-8]。唐琳等[9]用組織芯片儀制備組織芯片并結合免疫組化方法技術，檢測56例卵巢上皮性癌患者組織中ERCC1蛋白的表達情況，并以38例正常卵巢組織作為對照，分析其與順鉑化療耐藥的關系，結果證實上皮性卵巢癌ERCC1表達與順鉑化療耐藥相關。隨著分子生物學技術的改進，人類基因組測序工作完成，部分基因治療已進入臨床試驗階段，而且已在多種基因治療的基礎性研究中顯露鋒芒。例如，陳國強等[10]實驗研究證實，RCC1的表達水平與復發性卵巢上皮癌患者耐藥性產生相關。本實驗采用腺病毒感染人卵巢癌SKOV3/DDP細胞株的方法，干擾ERCC1的表達，觀察其體外逆轉卵巢癌對順鉑耐藥的效果。

采用重組腺病毒載體感染卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP，MTT實驗結果表明，載體腺病毒對細胞生長無明顯抑制作用，而重組腺病毒具有抑制細胞生長的作用，具有劑量依賴性，SKOV3/DDP在感染了重組腺病毒后，其對順鉑的IC50逐漸下降，順鉑的敏感性逐漸增加，耐藥指數由1.79降低為1.19，接近敏感株水平[5]，組腺病毒干擾ERCC1表達后對SKOV3/DDP具有逆轉順鉑耐藥作用，并且呈劑量依賴性。通過觀察細胞形態變化發現，重組腺病毒載體感染的細胞變圓，體積稍大，細胞間的連接較疏松，表明抑制ERCCl基因表達，使耐藥腫瘤細胞生長受到一定的抑制，高于重組腺病毒對敏感株的抑制作用，這可能與端粒酶的活性與卵巢癌細胞株的耐藥性有關[11]。

流式細胞檢測發現正常生長狀態下SKOV3/DDP細胞多數處于G1期，S期次之，G2/M期最少，細胞增生活躍程度弱于敏感株，與耐藥株倍增時間大于敏感株一致[5]。重組腺病毒對耐藥株SKOV3/DDP細胞具有較弱S期阻滯和誘導凋亡的作用。順鉑對耐藥株SKOV3/DDP細胞的S期阻滯作用及誘導細胞凋亡作用弱于敏感株SKOV3細胞，由此導致SKOV3/DDP對順鉑耐藥。而重組腺病毒聯合順鉑作用下，SKOV3/DDP細胞周期阻滯于S期比例增加，細胞凋亡率增高，表明重組腺病毒通過干擾ERCCl基因表達，增加順鉑對耐藥株的S期的阻滯、抑制細胞DNA復制、促進細胞凋亡。重組腺病毒干擾ERCCl基因表達，逆轉順鉑耐藥可能與調節腫瘤細胞周期分布及誘導腫瘤細胞凋亡有關。

綜上所述，重組腺病毒可以通過抑制卵巢癌細胞ERCC1基因的表達、調節腫瘤細胞周期、誘導卵巢癌細胞凋亡等途徑部分逆轉卵巢癌順鉑耐藥。本研究將RNA干擾技術與基因重組及基因載體技術聯合應用，為基因治療逆轉卵巢癌順鉑化療耐藥提供了新的思路，為以ERCC1基因為靶基因治療卵巢癌、逆轉卵巢癌順鉑耐藥提供了可靠的實驗依據，但還是需要進行深入的動物實驗，來確證以ERCC1為靶基因的RNA干擾方法治療卵巢癌、逆轉卵巢癌順鉑耐藥的有效性。