三明野生黃精不定芽增殖和生根體系研究

鄭瑋璇 ，黃奔奔 ，俞涵曦 ，徐小萍 ，邵顏平 ，郭志鵬 ，何邱明，賴鐘雄*，林玉玲*

（1.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002；2.福建盤古中藥材有限公司，福建三明 365000）

黃精（Polygonatum sibiricum）屬于百合科黃精屬具肉質(zhì)根狀莖的多年生藥用草本植物，俗稱老虎姜、雞頭參、野山姜，以根莖入藥，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎功能。黃精的主要功能成分是多糖、皂苷和黃酮。多糖具有抗腫瘤、抗輻射、改善記憶、預防骨質(zhì)疏松癥等作用[1-2]；皂苷具有提高免疫力、延緩衰老等作用[3]；黃酮具有抗氧化、降血糖、調(diào)血脂、預防動脈粥樣硬化等作用[4]。黃精為兼具食用、藥用和觀賞價值的經(jīng)濟植物，具有廣闊的開發(fā)利用前景。福建是黃精的產(chǎn)地之一，三明市是福建道地中藥材的主要產(chǎn)區(qū)之一。三明黃精樣本中多糖含量已經(jīng)超過了《中國藥典》[5]中黃精合格含量的3倍之多，藥效更足。黃精產(chǎn)業(yè)在健康大背景下后市看好，但產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在資源枯竭且質(zhì)量不穩(wěn)定、人工栽培種質(zhì)混亂技術滯后、功效物質(zhì)基礎不明確等問題[6]，急需加強對其繁育技術和核心功效物質(zhì)的基礎研究。

黃精的繁殖方式主要有有性繁殖（種子繁殖）和無性繁殖（塊莖繁殖）2種。由于黃精種子難收集，種子發(fā)芽率低，而且種子繁殖育苗時間長，種子繁殖至少5年以上才能收獲[7]，這樣就大大增加了黃精的栽培成本，不利于黃精的人工大面積種植。在當前的人工栽培中，黃精繁殖主要依靠根莖的無性繁殖，但該方法繁殖系數(shù)低，種根莖用量大，既不經(jīng)濟，又限制了黃精的產(chǎn)量潛力，不便栽植管理推廣[8]。僅靠野生資源來生產(chǎn)藥品遠不能滿足整個醫(yī)藥市場的需求。因此，建立更加高效的組織培養(yǎng)快繁體系是目前黃精快速繁殖的重要突破口。

增殖和生根培養(yǎng)是黃精組織培養(yǎng)的難點，是實現(xiàn)工廠化、規(guī)模化育苗的關鍵技術。關于同屬植物多花黃精（P.cyrtonema）的增殖和生根體系已有不少研究。徐忠傳等[9]的研究表明，6-BA對黃精不定芽增殖起顯著促進作用，是目前較為常用的芽增殖植物生長調(diào)節(jié)劑。通過許麗萍等[10]的研究可知，僅單獨使用6-BA也能達到較好的增殖效果，60 d左右增殖系數(shù)超過3。程強強等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TDZ有利于多花黃精不定芽增殖，但不定芽生長較慢，繼代1個月的增殖苗仍不能用于生根。6-BA與TDZ組合培養(yǎng)，雖然可縮短生根時間，但增殖效率不高，需要進一步優(yōu)化激素配比。劉紅美等[12]和李鶯等[13]分別對多花和雞頭黃精生根條件進行探索，發(fā)現(xiàn)最佳生根培養(yǎng)基均為1/2 MS+0.7 mg/L IBA，生根率為90%以上，有效解決了黃精組培快繁中生根率低的問題。李文金等[14]以泰山多花黃精試管苗為試驗材料，發(fā)現(xiàn)最佳生根條件為1/2MS+0.5 mg/L NAA+蔗糖20g/L+暗培養(yǎng)7 d，生根率高達96%。周新華等[15]對多花黃精生根培養(yǎng)條件進行研究，結(jié)果顯示多花黃精生根的最適基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，不同種類生長素對不定根的誘導能力的強弱依次為NAA＞IBA＞IAA，多花黃精組培苗的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，生根率為95%。這些均為該次試驗設計提供了參考依據(jù)。目前尚未見到關于福建三明野生黃精增殖體系和生根體系的報道，該研究以福建三明野生黃精為材料，建立高效不定芽增殖和生根體系，以期為工廠化、規(guī)模化的三明野生黃精育苗提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來源于福建盤古中藥材有限公司收集種植的福建三明野生黃精。于2017年12月及2018年4—5月挖出，后移至福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，埋藏于栽培基質(zhì)中。參考實驗室呂煜夢等建立的無菌體系進行消毒試驗（待發(fā)表，三明野生黃精無菌體系的建立與不定芽的誘導），將黃精塊莖從基質(zhì)中挖出，洗去泥土。剪去葉片和須根，用牙刷或毛刷清洗表面基質(zhì)土，用洗衣粉溶液浸泡，在流水下沖洗3 h，3%多菌靈浸泡2 d后用清水洗去表面多菌靈，然后晾干。在超凈臺用無菌水清洗1～2遍，取出塊莖于濾紙晾干，在接種盤中將塊莖根據(jù)節(jié)間長度切成小塊，較大的塊莖適當切小些。用體積分數(shù)75%乙醇進行表面消毒30 s，無菌水清洗1～2次；用0.2%升汞進行深度滅菌15min，同時滴1滴吐溫；無菌水清洗4～5次。

將消毒后的塊莖在MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上進行不定芽誘導，選擇生長健壯的無菌帶芽塊莖作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 不定芽增殖。將芽誘導試驗得到的無菌帶芽塊莖切成直徑0.5 cm大小的叢生芽塊，切除塊莖底部發(fā)黑褐化的部分以及部分葉片和苞衣后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為：（1）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D；（2）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L2，4-D；（4）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L2，4-D+0.5 mg/L IAA。以上4種培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8。30 d后觀察并統(tǒng)計芽增殖系數(shù)。

1.2.2 生根試驗。將叢生芽切開，保留葉片，分成單株，分別接種在添加不同濃度生長素NAA（0.2～1.0 mg/L）和IBA（0.2～1.0 mg/L）生根培養(yǎng)基上，3種培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8。每瓶接種6個塊莖，每個處理接種10瓶，45 d統(tǒng)計生根率，平均根數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)室溫度控制在（25±2）℃，光照強度為1 500～2 000 lx，每天光照時間16 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對不定芽增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，在相同6-BA濃度的基礎上添加不同濃度的IAA、2，4-D、TDZ對黃精帶芽塊莖進行培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計觀察結(jié)果見表1。將無菌外植體接入增殖培養(yǎng)基后約15 d有啟動趨勢，出現(xiàn)突出的芽原基；培養(yǎng)25 d左右原有不定芽周圍有大量新芽冒出，且其生長勢逐漸增強，有效芽逐漸增多（圖1）。由表1可知，在三明野生黃精增殖繼代的過程中隨著TDZ濃度的提高，不定芽增殖系數(shù)也相應提高。帶芽黃精塊莖在1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA的培養(yǎng)基中增殖效果最好，增殖系數(shù)最高，為3.02，但芽點較細長，部分葉片發(fā)生不規(guī)則彎曲。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對三明野生黃精不定芽增殖的影響

圖1 三明野生黃精不定芽增殖情況

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對組培苗生根的影響

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長素（NAA、IBA），培養(yǎng)15 d可見基部有白色的根系，培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計生根情況，結(jié)果如表2所示。以NAA為主的激素處理比以IBA為主的激素處理生根率高；從根系形態(tài)上來看，NAA濃度高的處理根系較為粗壯，IBA濃度高的處理根系較細弱。在IBA濃度相同的情況下，隨著NAA濃度的升高生根率呈上升趨勢。結(jié)果表明NAA誘導三明野生黃精生根的效果比IBA好，1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA生根率最高，為73.3%，但根數(shù)少，幼苗生長勢弱，不利于移栽成活。1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA生根率高，平均根數(shù)多，但同樣存在幼苗生長勢弱的問題。綜合考慮，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA為最適生根培養(yǎng)基，生根率為65.0%，平均生根數(shù)為7.67條，芽苗健壯（圖 2）。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對三明野生黃精生根的影響

圖2 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA誘導的三明野生黃精不定根

3 討論

3.1 TDZ對不定芽增殖有顯著促進作用

影響植物離體培養(yǎng)的因素有很多，包括外植體的品種、生理狀態(tài)、激素配比等。TDZ是一種高活性細胞分裂素，常用于木本植物組織培養(yǎng)[16]。TDZ能強烈促進愈傷組織、側(cè)芽及不定芽的發(fā)生，在許多植物芽增殖過程中有良好的效果[17-18]。三明野生黃精芽增殖試驗中發(fā)現(xiàn)，處理3（1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D）和處理 4（1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA） 的增殖系數(shù)顯著高于其他處理，可能由于TDZ對黃精芽增殖有較好的促進效果。徐紅梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TDZ促進多花黃精芽增殖的效果優(yōu)于6-BA處理，但對葉片生長不利，會導致畸形葉片的產(chǎn)生。這與該次試驗的結(jié)果相似，部分葉片出現(xiàn)不規(guī)則彎曲，葉片較為細長。為了保持葉片正常形態(tài)，增殖培養(yǎng)后期應將叢生芽塊轉(zhuǎn)接到不含TDZ的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導葉片正常生長。處理 1（1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D）與處理2（1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA）相比增殖效果更佳，可能由于該處理生長素濃度過高，對芽增殖產(chǎn)生抑制作用[20]。處理4的增殖效果優(yōu)于處理3，表明IAA和2，4-D一起處理增殖效果優(yōu)于單獨使用2，4-D。

3.2 NAA比IBA更有利于三明野生黃精生根

生長素能促進外植體生根。生長素IBA、NAA被廣泛應用于黃精及多花黃精生根誘導，如0.8～1.0 mg/L NAA[11，21]、0.7～1.0 mg/L IBA[12，22]為各報道中最佳的生根激素配比。在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，低濃度生長素如0.5 mg/L NAA、0.7 mg/L IBA處理下生根啟動慢、生根率極低，推測三明野生黃精需要較高濃度的生長素處理。試驗過程中發(fā)現(xiàn)三明野生黃精生根較為困難，這可能與三明野生黃精本身生根性質(zhì)有關。后期參考現(xiàn)有生根報道設計了8個處理，結(jié)果顯示NAA比IBA更適合誘導三明野生黃精生根，單獨使用1.0 mg/L IBA、NAA處理，1.0 mg/L NAA的生根率明顯高于1.0 mg/L IBA的處理。在1.0 mg/L NAA的基礎上添加一定濃度IBA對不定根的誘導有顯著促進作用。1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA是生根效果最佳的組合，生根率為70.0%，平均生根數(shù)6.62，但幼苗長勢弱，不利于移栽成活。綜合考慮，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA為生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基。

綜上所述，三明野生黃精最佳芽增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA，30 d增殖系數(shù)達3.02；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率為65.0%，平均根數(shù)7.67。該研究可為三明野生黃精規(guī)模化生產(chǎn)提供技術依據(jù)。