烏司他丁預處理對HepG2細胞氧化損傷保護作用的研究

楊巧俠 王成果 王元欣

摘要：目的? 探討烏司他丁（UTI）預處理對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用。方法? 將HepG2細胞常規培養傳代，隨機分為H2O2組，UTI100+H2O2組、UTI500+H2O2組、UTI1000+H2O2組及對照組，其中對照組不作任何處理，H2O2組，UTI100+H2O2組、UTI500+H2O2組、UTI1000+H2O2組分別加入濃度為0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI預處理，24 h后加入300 μmol/L H2O2處理4 h，體外模擬肝細胞損傷。CCK-8試劑盒和LDH試劑盒檢測LDH變化評價細胞損傷;TUNEL檢測細胞凋亡率;Western blot檢測HepG2細胞中LC3-Ⅱ、Cleaved caspase-3的表達變化情況。結果? 與H2O2組相比較，CCK-8和LDH檢測結果提示，各TUI預處理組能改善細胞生存環境，減輕H2O2對HepG2細胞的應激損傷，提高細胞活力（P<0.05）;TUNEL檢測提示預處理可降低氧化應激導致的凋亡率（P<0.05）; Western blot結果提示，與H2O2組比較，UTI可上調LC3-Ⅱ的表達（P<0.05），促進細胞自噬的發生，降低Cleaved caspase-3表達，抑制細胞凋亡 （P<0.05）。結論? UTI可以通過激活LC3-Ⅱ表達，促進細胞自噬，發揮保護作用，拮抗氧化應激導致的細胞凋亡。

關鍵詞：烏司他丁;自噬;凋亡;氧化應激

中圖分類號：R575.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.13.020

文章編號：1006-1959（2019）13-0072-05

Abstract：Objective? To investigate the protective effect of ulinastatin （UTI） preconditioning on oxidative stress injury in HepG2 cells.Methods? HepG2 cells were routinely cultured and randomly divided into H2O2 group， UTI100+ H2O2 group， UTI500+ H2O2 group， UTI1000+ H2O2 group and control group. The control group did not do any treatment. H2O2 group， UTI100+ H2O2 group， UTI500+ H2O2 group，UTI1000+ H2O2 group was pretreated with 0 μmol/L， 100 μmol/L， 500 μmol/L， and 1000 μmol/L UTI. After 24 h， 300 μmol/L H2O2 was added for 4 h to simulate hepatocytes in vitro. damage. CCK-8 kit and LDH kit were used to detect LDH changes to evaluate cell damage; TUNEL was used to detect apoptosis rate; Western blot was used to detect the expression of LC3-II and Cleaved caspase-3 in HepG2 cells. Results? Compared with the H2O2 group， the results of CCK-8 and LDH showed that each TUI pretreatment group could improve the cell survival environment， reduce the stress damage of? H2O2 on HepG2 cells， and increase cell viability （P<0.05）. TUNEL detection suggested pretreatment. The apoptosis rate induced by oxidative stress was reduced （P<0.05）.Western blot results showed that compared with H2O2 group， UTI could up-regulate the expression of LC3-II （P<0.05）， promote the occurrence of autophagy， decrease the expression of Cleaved caspase-3， and inhibit cell apoptosis （P<0.05）. Conclusion? UTI can promote the autophagy of cells by activating LC3-II expression， and play a protective role in antagonizing apoptosis induced by oxidative stress.

Key words：Ulinastatin;Autophagy;Apoptosis;Oxidative stress

肝臟擔負著人體的重要生理功能，肝臟損傷引起肝功能代謝障礙，繼而引起的一系列臨床癥狀，對患者造成一定的痛苦和經濟負擔。藥物性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病等肝病的共同病理基礎是肝細胞損傷[1]。烏司他丁（ulinastatin，UTI）是從健康男性尿液提取的一種蛋白酶抑制劑，具有強大的廣譜溶酶體酶抑制功能，具有穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用[2]。臨床上常用于急性胰腺炎、急性循環衰竭的救治。氧化應激是肝細胞損傷中一個重要的損傷機制，是各種肝臟疾病發生發展的共同病理基礎[3]。本研究通過模擬離體急性肝細胞損傷，探討UTI預處理對肝細胞自噬調控、凋亡的影響，為肝損傷的救治提供實驗和理論依據。

1材料與方法

1.1材料? 人肝癌細胞HepG2由中國科學院腫瘤醫院提供;胎牛血清購自Gibco公司;DMEM及0.25%胰酶購自美國Invitrogen公司;兔抗小鼠LC3B、β-actin、Cleaved caspase-3抗體購自于美國CST公司;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒美國Roche;山羊抗兔IgG/辣根酶標記二抗購自于武漢三鷹;細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8）購自于日本同仁公司;乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 HepG2細胞培養? 將HepG2 細胞常規復蘇，加入離心管中，吹打混勻，離心機中離心（800 r/min，5 min），棄上清，使用高糖型DMEM培養基并加10%胎牛血清配制而成的培養液，移入培養瓶中，于37℃ 5%CO2培養箱中常規培養。顯微鏡下觀察細胞，待細胞長至約85%密度時，可以傳代，經消化分散后，接種于塑料培養皿中，置于培養箱內進行培養。

1.2.2實驗分組? 將傳代好的HepG2細胞分隨機為5組，對照組不作任何處理，其余4組分別加入濃度為0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI預處理24 h后，加入300 μmol/L H2O2處理4 h，體外模擬肝細胞損傷。

1.2.3 CCK-8細胞活力檢測? 將HePG2細胞懸液濃度調整為5×107/L，每孔200 μL接種于96孔板上，按上述分組，每組接種8孔，經UTI預處理H2O2損傷后。加入20 μL 的CCK-8溶液在孵箱中繼續孵育2 h，在全自動酶標儀450 nm下檢測吸光度（optical density， OD）。

1.2.4 LDH釋放量測定? 各組經處理后，取其培養液。根據說明書配置標準品后，取其標準品和待測樣品各5 μl加入96孔板，每孔再加入底物工作液100 μl，37℃孵育5 min讀取吸光值A1。孵育30 min后用酶標儀在490 nm處測吸光值A2。再用A2值減去A1值等于最終OD值。以OD值為縱坐標，各標準品為橫坐標，作標準曲線。根據樣品OD值在該曲線圖上查出相對應的LDH含量。

1.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡? 4%多聚甲醛固定細胞，避光條件下，按9∶1混勻TUNEL試劑盒中的A液和B液，加入配置好的TUNEL反應液，加入待檢測細胞爬片中，放入37℃恒溫孵育1 h。PBS清洗后封片，Hoechst 染料染核5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算凋亡率。凋亡率=TUNEL陽性細胞數/Hoechst細胞總數×100%。

1.2.6 Western blot檢測LC3和Cleaved caspase-3表達變化? 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉移到硝酸纖維素膜上，和LC3（1∶3000）、Cleaved caspase-3（1∶500）與β-actin（1∶3000）抗體結合，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，電化發光法顯色后照相。最后用Image master VDS成像系統攝影，圖像分析件（Image J）行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin的蛋白產物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對量。并進行掃描圖像分析儀計算蛋白條帶的表達。

1.3統計學方法? 應用GraphPad prism 5軟件處理數據。連續變量以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，同組間兩兩比較用t檢驗進行統計學分析，以P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示統計學意義顯著，P<0.001表示統計學意義極顯著。

2結果

2.1各組CKK-8細胞活性檢測結果比較? 與對照組比較，H2O2組細胞活性顯著下降為（46.30±1.40）%;而UTI100+H2O2組，UTI500+H2O2組，UTI1000+H2O2組細胞活性隨濃度逐漸增強，分別為（53.58±1.80）%，（58.90±1.45）%，（66.08±0.89）%，見圖1。

2.2 LDH釋放量檢測? 結果顯示，各UTI處理組與H2O2組比較，LDH檢測率減少，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 TUNEL檢測細胞凋亡? 在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡如圖2所示。通過TUNEL陽性細胞計數，對照組陽性細胞（4.00±0.31）%，H2O2組神經元凋亡率達（62.80±0.86）%，UTI1000+H2O2組陽性細胞（34.00±0.70）%，對照組與H2O2組比較，統計學意義顯著（P<0.01），見圖3。

2.4 Western blot檢測LC3-Ⅱ和Cleaved caspase-3表達變化? Western blot結果提示，HepG2細胞H2O2處理后LC3-Ⅱ表達增高，隨著UTI預處理濃度越大，LC3-Ⅱ表達進一步增高，與H2O2組相比較，差異有統計學意義（P<0.05）;同時，在H2O2損傷發生后升高明顯，而UTI預處理組隨著濃度增加，Cleaved caspase-3蛋白表達減少，與H2O2組相比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4。

3討論

肝細胞損傷是一種由多因素介導的復雜的生物學過程，氧自由基的過度激活、脂質過氧化反應的引發和持續是肝病發生發展的重要病理過程之一[4]。正常生理情況下，自由基不斷產生、被清除，維持在動態平衡的情況下。當體內抗氧化系統對自由基清除能力不足時，細胞結構和功能受到破壞，引起脂質過氧化、酪氨酸硝化、線粒體呼吸鏈一直等多種途徑，造成核酸斷裂、蛋白交聯、變性和酶失活等。目前研究認為，氧化應激在肝臟疾病中的重要后果可能是改變了基因的表達，進而觸發炎癥反應、肝纖維化或癌變，或啟動或加強凋亡[5]。而凋亡抑制因子可能通過攻擊起關鍵作用的巰基，從而使Caspase喪失活性，通過抑制Caspase活性和參與調解核因子NF-kB的作用而抑制細胞凋亡，但這種攻擊可能同時導致壞死，尤其當自由基的濃度很高時更易引發壞死[6]。

研究發現，烏司他丁能抑制氧自由基的產生，抑制多種炎癥介質產生[7， 8]。臨床常用于胰腺炎、膿毒癥、多器官功能障礙綜合征等疾病的治療[9]。然而在多項顱腦損傷的研究中，證明烏司他丁可抑制神經細胞凋亡和死亡，改善神經細胞損傷，發揮腦保護作用[10-12]。有研究發現UTI可通過抑制多種炎癥物質，如彈性蛋白酶、氧自由基等，避免其作用肺血管，改善肺水腫臨床癥狀[13]。在大鼠的肝細胞損傷模型中，有人認為烏司他丁可以通過下調肝組織中NF-κB、p65表達，增強體內抗氧化能力[14]。而在UTI預處理可改善大鼠膿毒癥模型對心臟組織的損傷，具有保護作用其作用機制可能與UTI對應激反應，細胞信號轉導，能量代謝，免疫反應等相關基因表達的調節作用有關[15]。

本研究中，根據CCK-8活力檢測和LDH釋放檢測，結果表明，HepG2細胞對H2O2氧化損傷敏感，H2O2處理后細胞活力顯著降低，LDH漏出率明顯升高，而通過烏司他丁預處理組觀察，細胞活力有所增高。LC3-Ⅱ是自噬的標志性分子，其表達的高低與發生自噬的程度成正比[16]。Cleaved caspase-3表達水平反應了細胞的凋亡狀況[17]。相關研究表明，在HCV 感染的肝細胞中出現自噬泡堆積現象，說明HCV病毒阻止自噬泡與溶酶體融合，從而避免病毒被溶酶體降解[18]。而通過脂多糖/D-半乳糖胺可以提高細胞中的自噬作用，保護野生型小鼠的急性肝損傷，細胞自噬對肝細胞具有保護作用[19]。因此，本研究進一步通過Western blot手段檢測LC3-Ⅱ和Cleaved caspase-3表達。結果發現，與H2O2組比較，UTI處理組LC-Ⅱ表達增高，并呈濃度依賴性，Cleaved caspase-3表達則表達下降，說明通過UTI預處理，細胞自噬表達增強，凋亡分子表達減少。

氧化應激的發生在一定程度上會激活細胞的凋亡[20]，通過凋亡的發生可以阻斷病毒復制或清除受損、衰老的肝細胞，維持肝臟內環境的穩定。而肝細胞過度凋亡會導致肝細胞壞死，嚴重的肝損傷、甚至肝功能衰竭的發生。自噬和凋亡兩者之間可以相互轉變，細胞內部可以通過應激依賴的幸存機制調控來恢復細胞使其達到穩態，所以，在外界條件刺激下，細胞會通過自噬清理受損線粒體，以避免凋亡因子進入細胞里激活凋亡信號。

肝損傷是臨床上常見的疾病，對各種肝病所致的肝細胞損傷的病理機制至關重要，而尋找有效的防治藥物仍然同樣重要。盡管國內外目前關于UTI對肺損傷、胰腺炎和休克等危重傷病保護機制的研究，已經取得了極大的進展。但關于UTI在肝病中作用和機制研究較少，而對于UTI預處理可以影響細胞的轉歸，特別是凋亡和自噬的影響更值得我們進行深入的研究。

參考文獻：

[1]李白雪，張技，吳疆，等.體外肝細胞損傷模型分子機制探討[J].現代生物醫學進展，2014（9）：1786-1789.

[2]Leng Y.Ulinastatin for acute lung injury and acute respiratory distress syndrome： A systematic review and meta-analysis[J].World Journal of Critical Care Medicine，2014，3（1）：34.

[3]金明，王玉嬌，金梅花，等.兩種細胞建立肝細胞氧化損傷模型比較[J].中國公共衛生，2015（3）：324-326.

[4]Jaeschke H，Ramachandran A.Reactive oxygen species in the normal and acutely injured liver[J]. Journal of Hepatology，2011，55（1）：227-228.

[5]Guan L.Mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and protective effects of nitric oxide[J].World Journal of Gastrointestinal Surgery，2014，6（7）：122.

[6]Sutter AG，Palanisamy AP，Justin D，et al.Intereukin-10 and Kupffer cells protect steatotic mice livers from ischemia-reperfusion? injury[J].European Cytokine Network，2014，25（4）：69-76.

[7]Zhao G，Zhu Y，Yu D，et al.The effect of ulinastatin on hyperglycemia in patients undergoing hepatectomy[J].Journal of Surgical Research，2015，193（1）：223.

[8]Luo GJ，Yao WF，He Y，et al.Ulinastatin prevents acute lung injury led by liver transplantation[J].Journal of Surgical Research，2015，193（2）：841-848.

[9]孫文棟，徐詩雄，陳實.烏司他丁和奧曲肽聯合治療重癥急性胰腺炎的療效及血流變學觀察[J].中國生化藥物雜志，2014（5）：113-115.

[10]饒維，張磊，曹寶萍，等.不同劑量烏司他丁預處理對小鼠創傷性腦水腫的影響[J].中華神經外科疾病研究雜志，2012（2）：113-116.

[11]曹寶萍，張磊，蘇寧，等.烏司他丁對創傷性腦損傷的保護作用研究[J].中華神經外科疾病研究雜志，2013（3）：244-246.

[12]李兵，胡世頡，王冰，等.重度顱腦損傷合并多器官功能衰竭應用烏司他丁治療效果的臨床研究[J].陜西醫學雜志，2015（12）：1650-1652.

[13]Cui T，Zhu G.Ulinastatin attenuates brain edema after traumatic brain injury in rats[J].Cell Biochem Biophys，2015，71（2）：595-600.

[14]鐘毓杰，劉忠民，黃勇平，等.烏司他丁聯合粉防己堿預處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[J].肝膽胰外科雜志，2017，29（02）：134-137.

[15]Lin JD，Cai Y，Xiao XJ，et al.Effect of ulinastatin preconditioning on gene expression profile of heart tissue in a rat sepsis model[J].Chinese Critical Care Mediccine，2010，22（9）：547-552.

[16]王元欣，張磊，岳康異，等.SIRT3在氧糖剝奪再灌注損傷小鼠神經元中的表達及意義[J].現代生物醫學進展，2018（5）：817-821.

[17]Lavrik IN，Golks A，Krammer PH.Caspases：pharmacological manipulation of cell death[J].J Clin Invest，2005，115（10）：2665-2672.

[18]Chu VC，Bhattacharya S，Nomoto A，et al.Persistent Expression of Hepatitis C Virus Non-Structural Proteins Leads to Increased Autophagy and Mitochondrial Injury in Human Hepatoma Cells[J].PLoS One，2011（6）：e2855112.

[19]Rautou PE，Cazals-Hatem D，Moreau R，et al.Acute liver cell damage in patients with anorexia nervosa：a possible role of starvation-induced hepatocyte autophagy[J]. Gastroenterology，2008，135（3）：840-848.

[20]Simon HU，Haj-Yehia A，Levi-Schaffer F.Role of reactive oxygen species（ROS）in apoptosis induction[J].Apoptosis，2000，5（5）：415-418.

收稿日期：2019-4-15;修回日期：2019-4-25

編輯/宋偉