實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)百日咳鮑特菌的效能研究

王青，劉瑩，袁林，孟慶紅，姚開(kāi)虎

百日咳是由百日咳鮑特菌（bordetella pertussis，BP）引起的急性呼吸道感染性疾病，該病具有較強(qiáng)的傳染性。盡管有疫苗接種預(yù)防措施，百日咳依然在全世界范圍內(nèi)流行［1］。近年來(lái)，多個(gè)疫苗接種率較高的國(guó)家，包括美國(guó)、英國(guó)和澳大利亞，相繼報(bào)道百日咳發(fā)病率在保持多年低水平后再次升高［2-3］，引發(fā)學(xué)者關(guān)注。同樣，我國(guó)也存在百日咳反彈跡象。近期局部地區(qū)的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果提示國(guó)內(nèi)百日咳并不少見(jiàn)［4-5］，但監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)卻顯示在百日咳發(fā)病率下降或上升階段，沒(méi)有百日咳流行的周期性波動(dòng)，提示百日咳上報(bào)數(shù)據(jù)可能未能反映其真實(shí)發(fā)生狀況，可能是因?yàn)榘偃湛葘?shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法不普及。百日咳實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括細(xì)菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測(cè)細(xì)菌核酸、血清學(xué)檢測(cè)抗體水平等，其中百日咳細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，距離契合臨床需求具有一定的距離，而血清學(xué)要在病程后期才具有明確的診斷意義［6-7］。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR）試劑盒進(jìn)行快速的百日咳檢測(cè)，不僅能迅速掌握疫情，也為盡早開(kāi)展臨床治療提供病原學(xué)依據(jù)，且國(guó)內(nèi)已有商品化的百日咳Q-PCR試劑盒。為了更客觀地評(píng)價(jià)Q-PCR試劑盒在百日咳檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，開(kāi)展了本次調(diào)查研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年11月—2017年4月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院采集無(wú)熱咳嗽患兒〔無(wú)熱咳嗽為病程中有咳嗽，伴一過(guò)性低熱（＜24 h）或無(wú)熱〕鼻咽拭子302例，以及臨床診斷為百日咳患兒鼻咽拭子50例。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)熱咳嗽且年齡＜1歲者；排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重呼吸道感染及先天性氣道發(fā)育異常或畸形引發(fā)的咳嗽者，支氣管哮喘、支氣管異物、肺不張及胸腔積液等其他原因引起的咳嗽者。百日咳臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：咳嗽持續(xù)時(shí)間≥2周且伴有下列至少1個(gè)癥狀：痙攣性咳嗽；雞鳴樣回聲；無(wú)其他明顯原因的咳嗽后嘔吐［7］。本研究獲得本院倫理委員會(huì)審批，患兒家屬均知情同意。

1.2 主要試劑 碳瓊脂選擇培養(yǎng)基（CM0119 CHARCOAL AGAR）及選擇性培養(yǎng)基添加物—頭孢拉定購(gòu)自O(shè)XOID；脫纖維羊血購(gòu)自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；采樣用鼻咽拭子為藻酸鈣拭子，購(gòu)自Puritan Medical Products Company（25-801 A 50）；Q-PCR 試劑盒（Cat.#DA-BN479）購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司（中國(guó)）。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 鼻咽拭子標(biāo)本采集采用美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）推薦方法［8］。手持細(xì)長(zhǎng)拭子，經(jīng)鼻垂直于面部或人體冠狀面插入直至鼻咽后壁，充分接觸和擦拭鼻咽后壁表面后取出，建議雙側(cè)鼻咽分別采集一份拭子標(biāo)本（見(jiàn)圖1）。采集完畢的拭子即刻作為接種工具，反復(fù)“Z”字型劃線(xiàn)接種于碳瓊脂選擇培養(yǎng)基，置于37 ℃孵箱培養(yǎng)。3 d后開(kāi)始每天檢查培養(yǎng)皿，至第7天結(jié)束。若見(jiàn)灰白色、圓形、半透明的疑似菌落，應(yīng)繼續(xù)分離提純操作并對(duì)最終收集到的菌落進(jìn)行BP血清玻片凝集試驗(yàn)，百日咳血清凝集試驗(yàn)確認(rèn)為陽(yáng)性的菌落為BP。鼻咽拭子在接種后立即放置-70 ℃?zhèn)錂z。

1.3.2 DNA提取 鼻咽拭子標(biāo)本管中加0.9%氯化鈉溶液2 ml，充分振蕩；取1.5 ml浸出液于EP管中，12 000 r/min離心5 min（離心半徑8.6 cm），棄上清液；將沉淀加入50 μl DNA提取液中充分混勻，100 ℃干浴10 min，4 ℃冰浴1 min，12 000 r/min離心5 min（離心半徑8.6 cm），吸取上清液備用。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系 （1）BP PCR反應(yīng)液A 17 μl，BP PCR 反應(yīng)液 B 3 μl，DNA 模板 5 μl，共 25 μl。（2）PCR擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)，激活UDG酶；95 ℃ 15 min，1 個(gè)循環(huán)，變性；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)，退火。（3）PCR結(jié)果判讀：CT值＜26 Hu為陽(yáng)性，26～30 Hu為弱陽(yáng)性，＞30 Hu為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用JMP 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)或絕對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制四格表，計(jì)算靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法篩查302份無(wú)熱咳嗽患兒鼻咽拭子302份無(wú)熱咳嗽患兒鼻咽拭子標(biāo)本中，細(xì)菌培養(yǎng)、Q-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為4.6%（14/302）、7.6%（23/302）。以細(xì)菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Q-PCR檢測(cè)的靈敏度為78.6%（11/14），特異度為95.8%（276/288），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為47.8%（11/23），陰性預(yù)測(cè)值為98.9%（276/279）（見(jiàn)表1）。

2.2 兩種檢測(cè)方法篩查50份臨床診斷百日咳病例 在50例臨床診斷百日咳病例的鼻咽拭子標(biāo)本中，Q-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為34.0%（17/50），細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率為22.0%（11/50），兩者陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.125，P=0.077）。

3 討論

百日咳是由BP引起的一種傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、具有潛在致命風(fēng)險(xiǎn)的急性呼吸道傳染病。百日咳病情嚴(yán)重程度不一，臨床表現(xiàn)可從輕微呼吸道感染癥狀［9］到危及生命［10-11］。在疫苗廣泛接種之前，百日咳曾是兒童致死率最高的感染性疾病之一。其典型臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性痙攣性咳嗽，咳嗽終末伴有雞鳴樣回聲和外周血淋巴細(xì)胞增多。嬰兒尤其是＜3個(gè)月缺少保護(hù)性抗體的嬰兒，百日咳表現(xiàn)不典型［12-13］，早期誤診、漏診率高，且嬰兒病情常進(jìn)展迅速，在合并心血管功能障礙時(shí)救治難度大，病死率高，嚴(yán)重威脅嬰兒生命健康［14］。因此，提高百日咳臨床診斷效率，實(shí)現(xiàn)百日咳的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療意義重大。

百日咳流行具有一定的特點(diǎn)，每2～5年（平均3～4年）會(huì)出現(xiàn)一次百日咳流行高峰。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家已建立健全的百日咳檢測(cè)體系，其多年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，盡管疫苗免疫推廣后百日咳發(fā)病率顯著降低，但其流行周期并未發(fā)生改變，病原菌仍在社區(qū)循環(huán)傳播［15］，我國(guó)也有類(lèi)似情況。自1978年實(shí)施免疫規(guī)劃以來(lái)，我國(guó)百日咳發(fā)病率從20世紀(jì)60—70年代的（100～200）/10萬(wàn)下降至20世紀(jì)90年代的1/10萬(wàn)以下［16］，在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的穩(wěn)定后，近幾年來(lái)多個(gè)地區(qū)報(bào)道其發(fā)病率開(kāi)始顯著上升［17-19］。尤其是在2018年7月百白破疫苗效價(jià)不足事件發(fā)生后，多家醫(yī)院和疾病預(yù)防控制中心開(kāi)始恢復(fù)相關(guān)檢查，但實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)為百日咳診斷提供特異的線(xiàn)索非常有限。百日咳感染后常有白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，但通過(guò)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化判斷百日咳感染的特異性不高［20］。血清學(xué)檢測(cè)方法也一直是流行病學(xué)調(diào)查的重要手段。然而，血清學(xué)檢測(cè)常對(duì)于病程晚期的百日咳臨床診斷更有價(jià)值［6-7］。據(jù)報(bào)道，人百日咳IgG（PT-IgG）診斷百日咳最為敏感［21］，但檢測(cè)時(shí)需采集雙份血清檢測(cè)其中PT-IgG，若第二份血清中抗體水平比第一份升高3～4倍則診斷為百日咳的準(zhǔn)確率大幅提高［22］。但在實(shí)際操作中，采集雙份血清較為困難，因此目前多數(shù)國(guó)家采用不同的血清PT-IgG界值進(jìn)行單份血清檢測(cè)。我國(guó)有研究者采用30 U/ml或40 U/ml作為單次血清學(xué)診斷界值［23-24］。細(xì)菌培養(yǎng)仍是診斷百日咳的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其特異度高，方法成熟，是目前診斷百日咳的有效方法。但是，BP對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，需在35～37 ℃、高濕度、低二氧化碳（CO2）的環(huán)境下生長(zhǎng)，很多臨床科室受限于以上條件而無(wú)法進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)。此外，由于所需時(shí)間較長(zhǎng)，容易造成培養(yǎng)過(guò)程中雜菌尤其是真菌污染。而臨床標(biāo)本采集方法、標(biāo)本運(yùn)送系統(tǒng)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件以及是否進(jìn)行過(guò)抗感染治療等多種因素會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)陽(yáng)性率較低［25-26］。自20世紀(jì)80年代末，Q-PCR已成為一種成熟的檢測(cè)百日咳病原菌的方法。Q-PCR可通過(guò)TaqMan熒光探針進(jìn)行檢測(cè)，較傳統(tǒng)PCR又進(jìn)一步提高了靈敏度與特異度；且因整個(gè)反應(yīng)在封閉的PCR管中進(jìn)行，無(wú)須電泳步驟，可減少假陽(yáng)性的可能。Q-PCR檢測(cè)百日咳病原菌在臨床實(shí)際應(yīng)用中具有非常重要的意義。

圖1 鼻咽拭子采集方法示意圖Figure 1 Proper technique for obtaining a nasopharyngeal specimen for isolation of bordetella pertussis

表1 兩種檢測(cè)方法篩查302份無(wú)熱咳嗽患兒鼻咽拭子（例）Table 1 Nasopharyngeal swabs from 302 children with afebrile cough between two methods

本研究結(jié)果顯示，以細(xì)菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Q-PCR檢測(cè)的靈敏度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值均較高，對(duì)臨床排除百日咳的診斷有一定指導(dǎo)意義，與相關(guān)研究結(jié)果一致［27］。本研究中Q-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為7.6%，略低于韓玉玲等［28］的研究中用PCR檢測(cè)方法篩查遷延性咳嗽（持續(xù)咳嗽≥2周）的陽(yáng)性率，可能與篩查入組病例不同有關(guān)。Q-PCR篩查陽(yáng)性的23例患兒中有11例細(xì)菌培養(yǎng)亦陽(yáng)性，因此耗時(shí)短的Q-PCR檢測(cè)對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)百日咳病例有重要意義。

本研究中檢測(cè)的50例臨床診斷百日咳病例的標(biāo)本中，Q-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為34.0%，數(shù)值上稍高于細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率（22.0%），可能與檢測(cè)樣本例數(shù)少、本院就診患兒的病程偏晚已經(jīng)錯(cuò)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)和Q-PCR檢測(cè)的最佳時(shí)機(jī)有關(guān)。需要注意的是，臨床診斷百日咳患兒中98.0%（49/50）在就診前就已經(jīng)使用了抗生素，但其細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率達(dá)到22.0%，與Q-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率仍相當(dāng)，可能由于BP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥情況嚴(yán)重［29］，培養(yǎng)未受到抗生素使用的影響。

鼻咽拭子的材質(zhì)對(duì)Q-PCR檢測(cè)有一定影響。有學(xué)者認(rèn)為，如果需要同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及Q-PCR檢測(cè)，可使用達(dá)克龍或尼龍材質(zhì)的拭子（棉刷因含有對(duì)BP有毒物質(zhì)，會(huì)影響培養(yǎng)結(jié)果，但可單獨(dú)用于Q-PCR分析；藻酸鈣拭子對(duì)Q-PCR檢查可能產(chǎn)生影響，僅用于細(xì)菌培養(yǎng)）［30-33］。本研究中使用藻酸鈣拭子同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和Q-PCR檢測(cè)。如果采用棉刷，Q-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率可能會(huì)有所增加。由于對(duì)Q-PCR方法的依賴(lài)，歐美近期研究中細(xì)菌培養(yǎng)確診的數(shù)據(jù)缺乏，國(guó)內(nèi)近年來(lái)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)道也較少，但細(xì)菌培養(yǎng)仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。因此本研究中，以細(xì)菌培養(yǎng)驗(yàn)證的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果分析更為客觀和準(zhǔn)確。

本研究以細(xì)菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Q-PCR檢測(cè)的靈敏度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值均較高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值略低。檢測(cè)臨床百日咳病例時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)和Q-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率相當(dāng)。且Q-PCR具有耗時(shí)短，有商品化試劑盒，操作平臺(tái)也日益普及的優(yōu)勢(shì)，可靠的Q-PCR檢測(cè)必將成為國(guó)內(nèi)臨床診斷和排除百日咳的重要選擇。

作者貢獻(xiàn)：王青、姚開(kāi)虎進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，結(jié)果的分析與解釋?zhuān)撐男抻啠恼沦|(zhì)量控制及審校；劉瑩進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；袁林、孟慶紅進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理；王青進(jìn)行論文的撰寫(xiě)；姚開(kāi)虎對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。