兩親性大分子季銨鹽對水稻紋枯病菌抑菌活性表征方法研究

董辰韻，常瑤瑤，鐘偉強，張安強，林雅鈴

（1.華南農業大學材料與能源學院，廣東 廣州 510642；2. 華南理工大學材料科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種制約水稻生產的重要真菌病害［1-2］，目前化學藥劑防治仍是最重要的防治手段［3-5］。季銨鹽是一種廣譜性滅菌劑，常應用于醫療衛生事業的消毒滅菌，對微生物有良好的抑菌和殺菌效果。大分子季銨鹽不僅具有小分子季銨鹽良好的抑菌活性，還可克服小分子季銨鹽易揮發、穩定性差和環境毒性強等弱點［6］，將其應用于微生物的抑制是當今研究和開發的一個熱點［7］。兩親性大分子季銨鹽是一種分子鏈中同時含有親水鏈段和疏水鏈段的高分子聚合物，能通過親疏水作用穩定吸附于固體材料表面，并降低水在材料表面的張力，故也被認為是一種廣義的表面活性劑。臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）是針對膠束系統而言的，當溶液中存在的聚合物（通常為表面活性劑兩親性分子）開始大量形成膠束時的濃度即為CMC。當聚合物在溶液中的濃度高于CMC時，聚合物就會自發聚集形成膠束，而當濃度低于CMC時，自由的聚合物鏈不易形成穩定的膠束。其中兩親性聚合物的膠束CMC一般在10-6mol/L，而小分子的表面活性劑的CMC則大約為10-3mol/L［8］。因此，兩親性聚合物在水溶液中的溶解性不如兩親性小分子化合物，前者更易在溶液中形成膠束，而這類在溶液中易形成膠束的兩親性大分子季銨鹽對病原真菌抑菌活性的表征方法及效果，目前還鮮有報道。【前人研究進展】研究化合物對病原微生物抑菌活性的方法有多種。對病原細菌的表征方法有抑菌圈法［9］、管碟法［10］、濾紙片法［11］等。對病原真菌的表征方法有生長速率法［12-16］、菌絲稱重法［17］、孢子萌發法［18-19］等，其中生長速率法因其操作簡單，結果直觀而應用廣泛，但其只適用于在培養基中溶解性好且分布均勻的化合物表征；菌絲稱重法適用于能在培養基中溶解的化合物表征；而孢子萌發法只適用于能產生孢子的病原真菌?！颈狙芯壳腥朦c】分別利用生長速率法和菌絲稱重法對3種不同結構的季銨鹽，即一種新型兩親性大分子季銨鹽〔聚二甲基硅氧烷-b-聚丙烯酸酯季銨鹽嵌段共聚物，PDMS-b-(PDMAEMA-BCA)，簡稱Six-Q5〕、親水性大分子季銨鹽（PQD-BC）和小分子季銨鹽（BC）對水稻紋枯病菌（R. solani）抑菌活性進行系統表征，比較了兩種方法的優缺點?！緮M解決的關鍵問題】探索出適用于兩親性大分子季銨鹽對植物病原真菌的抑菌活性表征方法，為高分子季銨鹽作為植物病原真菌殺菌劑開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1(IA)），由華南農業大學農學院植物病理學系真菌實驗室惠贈。

苯扎氯銨（十二烷基二甲基芐基氯化銨，BC），99%，上海麥克林公司提供；聚二甲氨基丙基甲基丙烯酰胺-芐基氯化銨（PQD-BC），按文獻［1］采用自由基聚合方法合成，平均相對分子量為1.5×105；PDMS-b-(PDMAEMA-BC)的化學名稱為聚二甲基硅氧烷-b-聚(二甲氨基丙基甲基丙烯酸酯-芐基氯化銨)嵌段共聚物，是一類新型兩親性大分子季銨鹽（Six-Q5，x = 0、2、3、4、5、8、10），按文獻［20］采用原子轉移自由基聚合方法（ATRP）合成，其結構參數見表1。

PD培養基和PDA培養基按文獻［21］的方法配置。

表1 Six-Q5的結構參數Table1 Structural parameters of Six-Q5

1.2 試驗方法

1.2.1 生長速率法測試季銨鹽對R. solani的抑菌活性 將保留的R. solani菌絲接種于PDA平板中，倒置，在28 ℃恒溫培養箱中培養2 d后，在菌落邊緣打取6 mm菌碟，移至新的PDA平板，在相同溫度下培養2 d。在超凈工作臺中，配制不同濃度的季銨鹽（Six-Q5、PQD-BC和BC）溶液5 mL，倒入已融化的PDA培養基中，使其終濃度范圍在0.1～1 mg/mL，待培養基凝固后，向含藥PDA平板中央移接入從活化菌種邊緣打取的菌碟，28 ℃培養30 h，每個處理3次重復。用十字交叉法測量菌落直徑，計算相對抑制率：

1.2.2 菌絲稱重法測試季銨鹽對R. solani的抑菌活性 按照1.2.1實驗方法活化R. solani，在菌落邊緣打取菌碟移至45 mL PD培養基中，每瓶移接2個菌碟，28 ℃、120 r/min搖床中培養3 d，即可得到菌液。

在超凈工作臺中，稱取適量季銨鹽，紫外滅菌20 min后，用PD稀釋成一系列不同濃度，定容至8 mL，以相同體積的PD作為對照。于活化好的菌液中挑取適量菌絲，勻漿制成菌懸液（3×106～ 3×107CFU/mL），分別加入2 mL混勻的菌懸液于上述配制好的不同濃度的季銨鹽溶液中，混勻，置于28℃、150 r/min下培養48 h。

通過減重法，先將標記好的稱量瓶（含兩張定量濾紙）置于80℃下烘干3 h后，風干至室溫，稱得稱量瓶（含濾紙）質量（M1）；然后將對應標記的稱量瓶中的濾紙置于布氏漏斗中抽濾培養48 h菌藥混合液，并用PBS沖洗菌絲2次，洗去菌絲表面附著的季銨鹽，放回容量瓶中，再置于80℃下烘干3 h，風干至室溫，稱得稱量瓶（含濾紙）及菌絲的質量（M2），用減重法測量菌絲質量，計算相對抑制率：

式中，菌絲質量（g）= M2- M1。

1.2.3 毒力方程 以濃度對數作為橫坐標，根據《生物統計機率值換算表》，把抑制百分率換算成生物幾率值作為縱坐標，繪制毒力回歸方程。利用方程求得幾率值為5時的質量濃度即為IC50，幾率值為6.28155時的質量濃度為IC90。

2 結果與分析

2.1 生長速率法測試季銨鹽對R. solani的抑菌活性

半數抑制濃度（IC50）是指能抑制50 %病原微生物生長的藥物濃度，90 %抑制濃度（IC90）則是指抑制90% 病原微生物生長的藥物濃度［22］。IC50和IC90通常是用來評價化合物對病原微生物的抑菌活性。

圖1 Six-Q5季銨鹽對R. solani抑菌活性的菌落狀況Fig.1 Typical mycelial growth of R. solani in PDA medium treated with Six-Q5 quaternary ammonium salts

圖1是經過Six-Q5季銨鹽在不同濃度處理下生長2 d的R. solani菌落，由圖1可見，對比空白對照，各處理的R. solani菌落直徑明顯減小，說明經過季銨鹽處理，R. solani的生長受到了抑制。然而不同類型的季銨鹽對R. solani生長的抑制效果不同。本課題組在前期研究中發現，PQDBC和BC處理的菌落直徑隨著處理濃度的增加而減小［23］，但采用同樣的實驗方法用于Six-Q5對R. solani抑菌活性的表征時，其結果則出現了顯著的偏差：Six-Q5處理的樣品處理濃度對數值與計算所得的生物幾率值不呈線性關系，其結果見圖2。

通過采用生長速率法測量3類季銨鹽對R.solani抑菌活性的相關參數，發現PQD-BC和BC處理的擬合曲線擬合效果較好（r2＞ 0.95），分別為：y= 3.08x+ 9.04（r2= 0.960，IC50= 730 μg/mL，IC90= 1640 μg/mL）和y= 3.63x+ 5.50（r2= 0.964，IC50= 48.0 μg/mL，IC90= 127 μg/mL）。然而，Six-Q5處理的數據擬合效果不好（r2介于0.52～0.92之間，如圖2所示），說明通過擬合方程計算得到的IC50和IC90可信度不高，不適宜評價Six-Q5對R. solani的相對抑菌活性。

圖2 生長速率法測Six-Q5系列 (A～G)、PQD-BC (H)和BC (I)對R. solani抑菌活性擬合曲線Fig.2 Fitting curves of antibacterial activity of Six-Q5 series (A-G), PQD-BC (H) and BC (I) to R. solani by growth rate method

2.2 菌絲稱重法測試季銨鹽對R. solani的抑菌活性

由于生長速率法不能較好地表征兩親性大分子季銨鹽的抑菌活性，試驗嘗試了另一種方法，即菌絲稱重法［17］。

圖3為利用菌絲稱重法測量的菌絲干重計算得到的樣品處理濃度對數-生物幾率值的擬合曲線，由圖3可見，3類不同結構的季銨鹽處理的濃度-生物幾率值擬合曲線的擬合效果較好（r2＞ 0.96）,說明可以通過擬合曲線方程計算得到IC50和IC90（表2），且其可信度較高，可以用來評價3類不同結構季銨鹽對R. solani抑菌活性的大小。由表2可見，PDMS嵌段長度較長的Si8-Q5和Si10-Q5對R. solani的抑菌活性明顯弱于其余PDMS嵌段長度較短的Six-Q5（x= 0～5）和PQD-BC及BC，可能是因為當聚合物的親水段長度不變時，疏水段長度越長，聚合物的CMC越小，其在培養液中的溶解度降低，影響測試的IC50及IC90的準確性。

圖3 菌絲稱重法測Six-Q5 (A～G)、PQD-BC (H)和BC (I)對R. solani抑菌活性擬合曲線Fig.3 Fitting curves of antibacterial activity of Six-Q5 series (A-G), PQD-BC (H) and BC (I) to R. solani by mycelium weighing method

表2 基于菌絲稱重法測得3類季銨鹽對R. solani抑菌活性的相關參數Table2 Parameters of the antimicrobial activity of three kinds of quaternary ammonium salts against R. solani measured by mycelial weighing method

3 討論

3.1 生長速率法測試季銨鹽對R. solani的抑菌活性

用電導率法測得Six-Q5的臨界膠束濃度（CMC）的結果介于0.06～0.09 mg/mL之間，說明Six-Q5在水溶液中易于形成膠束，且膠束的尺寸較大，用透射電鏡測試的結果為50～500 nm。當在固體培養基中Six-Q5終濃度為0.1～1 mg/mL時，大于CMC，則形成膠束［8］，在固體培養基甚至靜置液體培養基中難以均勻分布，影響實驗結果，導致同一處理不同重復的結果波動較大；而親水性大分子季銨鹽（PQD-BC）和小分子季銨鹽（BC）在液體和固體中均能分布均勻，容易實現較為穩定的重復結果。這應該是生長速率法不適合兩親性大分子季銨鹽的抑菌活性表征的主要原因。

3.2 兩種方法測得季銨鹽對R. solani的抑菌活性比較

菌絲稱重法測試的PQD-BC及BC的IC50和IC90明顯小于生長速率法測得的結果，這可能和菌絲與樣品有效接觸面積有關。生長速率法中，菌碟只有一面緊挨毒平板，則只有貼著毒平板生長的菌絲會受到抑制，毒平板中的藥物難以抑制氣生菌絲的生長；而菌絲稱重法中，菌碟和菌絲是完全浸潤于藥物溶液中，且振蕩培養增加了藥物與菌絲的有效接觸頻率，從而增強了抑制效果，致使菌絲稱重法測試得到的IC50和IC90會比生長速率法的測試值小。

前期關于聚丙烯酸酯季銨鹽均聚物（PDMAEMA-BC）的研究發現，只有當聚合物的分子質量適當時（約為5 000 u，相當于本試驗中的Si0-Q5）才能獲得較佳的抑菌活性。但在本試驗中，雖然發現兩親性大分子季銨鹽（Six-Q5）分子結構中親疏水嵌段的比例對其抑菌活性有較大影響，通過調整疏水的PDMS嵌段長度（約為5 000 u）可以獲得與小分子季銨鹽相當抑菌活性的兩親性大分子季銨鹽，但PDMS嵌段長度與抑菌活性之間的規律性不甚明顯，相關機理仍有待進一步研究。

4 結論

生長速率法適用于在培養基中溶解性好、且分布均勻的化合物抑菌活性的表征。而像Six-Q5這類在水溶液中易于形成膠束，且膠束的尺寸較大的大分子化合物的抑菌活性表征則更適宜采用菌絲稱重法。