千年桐內(nèi)生真菌的分離鑒定及溶磷能力測(cè)定

朱 靜 ，洪陳潔 ，吳承禎 ，蘇少川，顏歡歡 ，林 晗

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程與經(jīng)營(yíng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.武夷學(xué)院，福建 南平 354300；4.南平市建陽(yáng)區(qū)林業(yè)局，福建 南平 354200）

【研究意義】千年桐（Aleurites montana）是大戟科油桐屬落葉喬木，主要分布于福建、廣西、廣東、江西等地，特點(diǎn)是生長(zhǎng)速度快，可作為短輪伐期的工業(yè)原料林樹種；種仁含油率高，是煉制生物質(zhì)柴油的優(yōu)質(zhì)原料。此外，由于千年桐凋落量大，還可以作為生態(tài)公益林的補(bǔ)植樹種，與針葉樹種混交可改良地力［1］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于千年桐在繁育技術(shù)、幼苗生長(zhǎng)特性和營(yíng)林技術(shù)上已取得相關(guān)研究［2］，如比較播種密度、播種時(shí)間、扦插培育、不同嫁接方式等對(duì)苗木生長(zhǎng)的影響［3］，千年桐在幼苗階段采取相關(guān)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育措施的研究［4］，純林與混交林的相關(guān)生理生態(tài)指標(biāo)分析等［5］。而在與內(nèi)生真菌有關(guān)的研究相對(duì)較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物內(nèi)生真菌是寄生在植物體內(nèi)與其共同生長(zhǎng)、相互作用并相互影響的一類真菌，一般不會(huì)使寄主植物產(chǎn)生不良影響［6］?，F(xiàn)有研究表明，內(nèi)生真菌能提高植物對(duì)養(yǎng)分的利用［7］，對(duì)許多植物具有促生作用；也能提高植物體內(nèi)的酶活性［8］，降低有害次生代謝物質(zhì)含量［9］，提高植物抗逆性［10］。同時(shí)，很多報(bào)道指出，植物內(nèi)生真菌還具有明顯的抑菌作用，如核桃內(nèi)生真菌對(duì)蘋果腐爛病原菌（Valsa ceratosperma）、核桃炭疽病原菌（Gloeosporium fructigenum）、辣椒疫霉病原菌（Phytophthora capsici）和小麥赤霉病原菌（Fusarium graminearum）均有抑制作用［11］?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】千年桐作為兼用林樹種，近年來(lái)其栽植與利用受到諸多關(guān)注。但是，由于閩北丘陵山地的地形限制，千年桐常栽植于人工管理不易、土壤瘠薄的陡坡。通過(guò)內(nèi)生真菌作用，提高千年桐的養(yǎng)分利用率和抗逆性，對(duì)減少肥料投入、降低生產(chǎn)成本、提高桐果產(chǎn)量和質(zhì)量均具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)千年桐內(nèi)生真菌的分離和鑒定，比較千年桐不同器官中內(nèi)生真菌分布和種類的差異；同時(shí)，磷作為植物生長(zhǎng)重要元素之一，土壤中高于95%磷元素卻未被有效利用，針對(duì)這一問(wèn)題最直接快速的方法是施用磷肥，但是南方紅壤的磷肥利用率較低、磷素固化嚴(yán)重，急需發(fā)展新的替代品來(lái)替代或一定程度緩解這一狀況［12］。篩選出具有較高溶磷效果的優(yōu)勢(shì)菌株，以期為閩北地區(qū)千年桐的優(yōu)質(zhì)栽培以及林木內(nèi)生真菌的應(yīng)用提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試千年桐材料于2014年采自福建省南平市建陽(yáng)區(qū)外墩采育場(chǎng)、湖橋工區(qū)和書坊林場(chǎng)，包括長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害的千年桐散生木，毛竹、杉木和千年桐混交林中的千年桐成熟木，以及千年桐純林中的成熟木，共29株，樹齡為10～15年。每株分別采集根、莖、葉器官樣本，葉片選擇健康的定長(zhǎng)葉片，根和莖樣品長(zhǎng)度約10 cm。采集后的材料放在密封袋中編號(hào)，并用浸濕濾紙覆蓋葉片和根系，用浸濕棉花包裹根莖兩端，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 千年桐內(nèi)生真菌的分離純化 將千年桐各器官表面沖洗30 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用75%酒精和15%次氯酸鈉依次漂洗。每次漂洗后用無(wú)菌水沖洗3～4次，并用無(wú)菌紙吸干水分。將表面消毒過(guò)的新鮮千年桐根段、莖段和葉片置于無(wú)菌玻璃片上，切割成5 mm×5 mm的組織塊。每個(gè)培養(yǎng)皿放入6～8個(gè)組織塊，置于改良馬丁培養(yǎng)基（魚蛋白胨5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母浸出粉2.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.4（±0.2）上。密封培養(yǎng)皿，于28 ℃恒溫箱中避光培養(yǎng)7 d。

培養(yǎng)期間，當(dāng)組織塊周圍有菌落出現(xiàn)時(shí)，根據(jù)菌落生長(zhǎng)速度、顏色的差異，用無(wú)菌接種針從組織塊周圍選取單一的菌落，并挑取其菌絲體接種至馬丁培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d待菌絲長(zhǎng)滿，重復(fù)純化培養(yǎng)3次后接種到斜面培養(yǎng)基〔馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）40.1 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0〕，并于4 ℃保存。

1.2.2 千年桐內(nèi)生真菌的鑒定 純化培養(yǎng)后，根據(jù)菌落形態(tài)挑取適量菌絲制成玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌落大小、顏色和紋路等特征，根據(jù)其顯微結(jié)構(gòu)，參照魏景超［13］的方法進(jìn)行菌株初步分類鑒定。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，將樣品送至上海邁浦生物科技有限公司通過(guò)18S rDNA進(jìn)行分子鑒定。

1.2.3 千年桐內(nèi)生真菌的篩選 綜合千年桐各個(gè)器官中生長(zhǎng)較快、長(zhǎng)勢(shì)較好菌株出現(xiàn)的頻率，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株。篩選方法為以3處采樣地的千年桐根、莖、葉3個(gè)器官中內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率為基數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，即有9個(gè)出現(xiàn)位置，如某一菌株出現(xiàn)于3處樣地的千年桐根系中，則其出現(xiàn)頻率為1/3。菌株生長(zhǎng)速度則以培養(yǎng)至7 d時(shí)菌落直徑的大小來(lái)表示。經(jīng)篩選得到的優(yōu)勢(shì)菌株采用三點(diǎn)接種法［14］分別接種在NBRIP無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基（葡萄糖10 g、磷礦粉5 g、氯化鎂5 g、硫酸鎂0.25 g、氯化鉀0.2 g、硫酸銨0.1 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0）［15］上，每個(gè)菌株3次重復(fù)，于25 ℃培養(yǎng)7 d，將具有明顯可見(jiàn)透明圈的菌落視為具有較高溶磷效果，記錄溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），以進(jìn)一步篩選具有較強(qiáng)溶磷能力的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 千年桐不同器官的消毒

本試驗(yàn)使用75%酒精和15%次氯酸鈉對(duì)千年桐不同器官表面進(jìn)行消毒。根據(jù)多次試驗(yàn)結(jié)果，各器官消毒的適宜時(shí)間為：使用75%酒精對(duì)千年桐根、莖、葉消毒30 s，無(wú)菌水沖洗后，用15%次氯酸鈉分別消毒根部7 min、莖部5 min、葉片7 min。將表面消毒后的千年桐根、莖和葉放入改良馬丁培養(yǎng)基于28 ℃恒溫箱中避光放置3 d，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)微生物長(zhǎng)出，確認(rèn)器官表面徹底滅菌。

2.2 千年桐內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

從千年桐根、莖、葉各器官中分離得到的內(nèi)生真菌情況（表1）可知，千年桐不同器官分離出的內(nèi)生真菌數(shù)量存在一定差異。從器官角度分析，莖中分離出的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，從3個(gè)采樣地的樣品莖部共分離出60株內(nèi)生真菌，占總數(shù)的38.71%；而根部分離出的內(nèi)生真菌較少，占總數(shù)的29.03%。從采樣地來(lái)看，湖橋樣地和書坊樣地的樣品中分離出內(nèi)生真菌的數(shù)量較多，分別占總數(shù)的49.68%和41.94%，外墩樣地樣品中分離出的內(nèi)生真菌僅有13株，占總數(shù)的8.39%。

表1 千年桐各器官內(nèi)生真菌分離結(jié)果Table1 The number of endophytic fungi isolated from different organs of Aleurites montana

2.3 千年桐內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

根據(jù)對(duì)菌落的形態(tài)學(xué)觀測(cè)和18S rDNA分子鑒定的結(jié)果，千年桐不同器官分離出的155株內(nèi)生真菌分別隸屬于以下14個(gè)屬：青霉屬（Penicilliumsp.）、 毛 霉 菌 屬（Mucorsp.）、嗜熱真菌屬（Thermomycessp.）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiasp.）、木霉屬（Trichodermasp.）、盾殼霉屬（Coniothyriumsp.）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma sp.）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、生赤殼屬（Bionectriasp.）、赤霉屬（Gibberellasp.）、鏈格孢屬（Alternariasp.）、漆斑菌屬（Myrotheciumsp.）、五隔盤單毛孢屬（Seiridiumsp.）、尼泊爾盤孢屬（Seimatoantleriumsp.）。

2.4 千年桐內(nèi)生真菌的篩選結(jié)果

根據(jù)菌株生長(zhǎng)速度和出現(xiàn)頻率的差異，從155株內(nèi)生真菌中篩選出25株優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)鑒定分別隸屬于毛霉菌屬、青霉屬、擬盤多毛孢屬、生赤殼屬、木霉屬、嗜熱真菌屬、鏈格孢屬、盾殼霉屬、鐮刀菌屬等9個(gè)屬。通過(guò)記錄菌株在NBRIP無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中的溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d），計(jì)算其比值，結(jié)果見(jiàn)表2。表2顯示，在優(yōu)勢(shì)菌株中篩選出具有較好溶磷效果的菌株4株。其中青霉屬菌株R1的菌落直徑和溶磷圈直徑最大，分別為2 cm和2.7 cm，青霉屬菌株R3的D/d值最大，為1.667。溶磷圈直徑與菌落直徑比值大小排列順序?yàn)镽3＞R1＞R2＞R4，初步判斷R3菌株具有相對(duì)較強(qiáng)的溶磷能力。

表2 千年桐溶磷菌的篩選結(jié)果Table2 The phosphprus-solubilizing endophytic fungi in Aleurites montana

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)菌、盆栽和大田3種栽培條件下，后兩者分離出的內(nèi)生真菌數(shù)量較前者明顯增加［16］。也有報(bào)道指出，內(nèi)生真菌生物量的高低受培養(yǎng)環(huán)境的影響［17］。本研究結(jié)果也表明，從湖橋、外墩、書坊樣地的千年桐中分離出的內(nèi)生真菌數(shù)目存在差異，說(shuō)明一定條件下環(huán)境因子可作用于宿主植株進(jìn)而對(duì)其內(nèi)生真菌產(chǎn)生影響。同時(shí)，內(nèi)生真菌在千年桐不同器官間的分布也存在差異，表現(xiàn)為莖部最多（38.71%）、葉片居中（32.26%）、根部最少（29.03%）的特征，這與陳志為等［18］對(duì)臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌的研究結(jié)果一致。一方面，土壤微生物可以侵染根部進(jìn)而隨著千年桐的生長(zhǎng)向上擴(kuò)展到莖部；另一方面，千年桐葉片表面積較大，空氣中的微生物有更多機(jī)會(huì)侵染，且葉片中的微生物也有機(jī)會(huì)擴(kuò)展到莖部［19］。此外，閩北地區(qū)的氣候和土壤條件也會(huì)對(duì)微生物結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生影響［20］。但相關(guān)報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，桑樹內(nèi)生真菌在根部數(shù)量最多［21］，馬尾松葉片中的內(nèi)生真菌數(shù)量高于根部和莖部［22］，而雷公藤內(nèi)生真菌呈現(xiàn)在枝條中分布數(shù)量最高的趨勢(shì)［23］，說(shuō)明內(nèi)生真菌在植物各器官間的分布也因植物種類而異。

對(duì)3個(gè)采樣地千年桐內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果顯示其分別隸屬于14個(gè)屬，而進(jìn)一步篩選出的25株優(yōu)勢(shì)菌株隸屬于9個(gè)屬，分別為毛霉菌屬、青霉屬、擬盤多毛孢屬、生赤殼屬、木霉屬、嗜熱真菌屬、鏈格孢屬、盾殼霉屬、鐮刀菌屬，初步明確了3個(gè)采樣地千年桐內(nèi)生真菌的組成。這與戴傳超等［24］在同為大戟科的澤漆（Euphorbia helioscopiaL.）、烏桕〔Sapium sebiferum（L.）Roxb.〕、大戟（Euphorbia pekinensisRupr.）、重陽(yáng)木（Bischo fi a polycarpa）等4種植物中分離得到的內(nèi)生真菌表現(xiàn)有共同的菌屬，分別為擬盤多毛孢屬、鐮刀菌屬和青霉屬。在植物內(nèi)生真菌的種類差異上，有研究表明，內(nèi)生真菌的繁殖擴(kuò)散會(huì)受其宿主基因型和環(huán)境因子（如溫度和海拔等）影響，且在環(huán)境條件和宿主基因型共同作用下，宿主針對(duì)易感內(nèi)生真菌的特性在自然環(huán)境下會(huì)發(fā)生改變，從而影響宿主內(nèi)生真菌的種類［25-26］。同時(shí)，在宿主植株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性生長(zhǎng)過(guò)程中，植物內(nèi)生真菌與土壤微生物之間的互作也導(dǎo)致植株內(nèi)生真菌種類的差異［27-28］。

根據(jù)前人研究，絕大多數(shù)溶磷菌株是從植物根際土壤中分離得到的，而青霉屬是其中最重要的一類溶磷菌［29-31］。本研究從千年桐植株中也提取出具有較高溶磷效果的青霉屬和嗜熱真菌屬內(nèi)生真菌菌株，擴(kuò)大了溶磷微生物資源。內(nèi)生真菌作為微生物資源，可以促進(jìn)宿主生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主對(duì)外界條件的抵抗能力、促進(jìn)宿主合成化學(xué)物質(zhì)［32-33］，這對(duì)提高千年桐生態(tài)公益林、短輪伐期工業(yè)原料林以及經(jīng)濟(jì)林的高優(yōu)栽培具有重大意義。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，千年桐內(nèi)生真菌數(shù)量在不同地點(diǎn)以及不同器官間分布有不同，表現(xiàn)為湖橋樣品分離內(nèi)生真菌的數(shù)量最多、外墩樣品最少，莖部最多（38.71%）、葉片居中（32.26%）、根部最少（29.03%）的特征。初步確定千年桐內(nèi)生真菌菌屬組成，即毛霉菌屬、青霉屬、擬盤多毛孢屬、生赤殼屬、木霉屬、嗜熱真菌屬、鏈格孢屬、盾殼霉屬、鐮刀菌屬，其中青霉屬和嗜熱真菌屬內(nèi)生真菌菌株具有較高的溶磷效果。