青籬柴轉錄組數據SSR位點的生物信息學分析

黃建敏 李菲 劉云靜

摘要：為探討青籬柴轉錄組中簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）位點信息，開發青籬柴分子標記技術，采用高通量測序技術獲得青籬柴轉錄組原始試驗數據，經過生物信息學軟件Trinity拼接后，獲得66 755條單基因簇（universal gene，簡稱unigene）。進一步采用生物信息學分析軟件MISA對所有的unigene進行SSR位點數據挖掘。共計搜索出22 542個SSR位點，分布在18 972條unigene中，出現頻率為33.77%，發生頻率為28.42%，SSR平均長度為15 bp，平均分布頻率是1/3.98 kb，在青籬柴轉錄組的SSR中，單核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重復序列為主要重復類型，分別占總SSR的47.59%、27.95%、23.45%。青籬柴轉錄組數據中SSR序列共包括161種重復基元類型。其中出現頻率高的基序主要有A/T、AG/CT、AAG/CTT、AT/AT、C/G、AGG/CTT。重復序列長度在10～144 bp之間，大多小于24 bp，大于24 bp的僅有0.22%（48個SSR位點）。另外，設計篩選得到15 425對SSR引物。綜上表明青籬柴SSR位點多態性潛能較高，具有很大的可開發性。

關鍵詞：青籬柴;轉錄組;SSR;重復類型;重復基元

中圖分類號：Q811.4 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0054-05

簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）是指由1～6個核苷酸為重復單位組成的串聯重復序列，隨機、廣泛、均勻地分布于真核生物基因組中，由于重復次數不同而造成簡單序列長度多態性（simple sequence length polymorphism，簡稱SSLP）[1]。不同物種的簡單重復序列差異很大，主要表現在重復次數、基序類型、長度以及在染色體上的分布情況等，從而反映出物種間高度的等位基因多樣性。雖然SSR具有高度多態性，但其兩端的序列一般都比較保守和專一，因此可憑借兩端的保守序列設計特異性的SSR引物，通過PCR技術擴增出SSR，再利用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術獲得其長度多態性，即SSR分子標記。由此開發的SSR分子標記技術具有操作簡單、穩定性好、分布豐富、易檢測、共顯性、等位基因變異多、遵循孟德爾遺傳定律、進化所受選擇壓力小以及種族特異性強等優點。目前，SSR分子標記作為重要的遺傳標記，已經在品種純度鑒定、基因功能定位、分子輔助育種、遺傳圖譜構建以及親緣關系分析等方面有廣泛的應用[2-3]。

早期開發SSR分子標記的方法主要是基因組文庫構建、克隆測序和通過公共數據庫中表達序列標簽（expressed sequence tag，簡稱EST）進行開發。所需費用高、時間周期長、步驟復雜、工作量大，且成功獲得SSR陽性克隆和多態性引物的概率很低[4]。鑒于當前新一代高通量測序技術發展迅速，測序成本顯著降低的狀況。利用高通量測序技術對植物進行轉錄組測序，具有快速高效、花費時間合理等優點，從基因的結構和功能出發，通過新一代高通量測序技術，除了可以全面快速地獲得某一特定組織或器官在特定狀態下幾乎所有的轉錄本信息，能可靠地發現大量特定組織在特定時間點的基因表達數據之外[5]，還可根據測序結果開發具有基因信息的SSR分子標記[6-8]，運用該方法，已在刺梨[9]、黨參[10]、茯苓[11]、魚腥草[12]、杜仲[13]等多種植物上開發出具有基因信息的SSR標記并應用于遺傳分析。

青籬柴（Tirpitzia sinensis）為亞麻科青籬柴屬下的一個種，屬灌木或小喬木。其莖、葉能消腫止痛、接骨，在民間有用藥歷史，但尚未見有關藥學研究報道，從民族植物學的角度是值得關注的物種。青籬柴花具有很好的觀賞價值，可以對其進行引種栽培。蔡湘文在黑葉猴的覓食生物學和營養分析的研究中提到，青籬柴的葉是黑葉猴喜食的種類之一[14]。杜小浪等在重慶市彭水縣進行第4次全國中藥資源普查中發現了青籬柴分布新紀錄，青籬柴的原分布區域位于重慶市的南面，重慶市可能是青籬柴分布的最北界，這對于植物譜系地理研究具有重要意義[15]。喻勛林等在湖南省都龐嶺自然保護區植物區系的研究中將青籬柴歸類為石灰巖特有（或適生）植物[16]。蔣水元等在對廣西壯族自治區石灰巖特有珍惜藥用植物類群的基本特征研究中，在藥用植物的分布區類型構成中，將青籬柴歸為熱帶亞洲（印度-馬來西亞）類[17]。國內外暫無單獨對青籬柴的研究報道。針對青籬柴研究的空白，開展青籬柴的遺傳多樣性研究，揭示青籬柴資源的親緣關系，探究其在不同地理分布區的遺傳差異，揭示其物種分化過程，能為青籬柴種質資源的保護和合理利用提供理論依據。本研究首次采用二代測序技術的方法，獲得大量青籬柴轉錄組序列信息，并對轉錄組數據中的SSR位點進行搜索和檢測，分析其分布及結構特點，并結合SSR引物設計綜合評價其可用性，以期為在分子水平上研究青籬柴遺傳多樣性提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 青籬柴材料及轉錄組數據來源

本試驗轉錄組測序樣本來源于貴州省黔東南苗族侗族自治州施秉縣云臺山，采取同一株青籬柴個體上的幼嫩葉片、花和枝干組織各1.5 g，進行等量混樣，迅速放入液氮，送北京諾禾致源科技股份有限公司提取mRNA，利用Illumina HiSeqTM 2000高通量測序平臺對其進行轉錄組測序，總計產出8.71 GB數據，干凈讀序經Trinity組裝后最終獲得66 755條unigene，總長度為 89 702 690 bp，平均長度為1 344 bp，過濾后質量不低于20的堿基比例（Q20，測序錯誤率<1%）為 97.47%，表明測序結果良好，可對獲得的數據進行進一步分析。

1.2 青籬柴轉錄組SSR的篩選

以組裝出來的unigene作為參考序列，使用MicroSAtellite（簡稱MISA）軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對青籬柴轉錄組中的SSR位點進行搜索和檢測。對應的各個核苷酸的最少重復次數分別為1-10、2-6、3-5、4-5、5-5、6-5（如1-10意思為以單核苷酸為重復單位時，其重復數至少為10才可以被檢測到;2-6意思為以二核苷酸為重復單位時，其最少重復數為6）。并且對不同SSR類型在基因轉錄本的密度分布進行統計。同時篩選被間隔≤100 bp 堿基打斷的復合型SSR。

1.3 青籬柴SSR引物設計

采用Primer 3.0（2.3.5版，默認參數）進行SSR引物設計，并針對預測到的每一個SSR位點分別設計3組引物供后期試驗選擇。

1.4 數據統計

將生成的文本文件導入到Excel中進行基本的統計分析。用SSR出現頻率、發生頻率及其分布的平均距離、重復類型、基元組成等分析青籬柴轉錄組SSR的分布特征，其中出現頻率=搜索到的SSR總數/總unigene序列數;發生頻 率= 有SSR分布的序列數/總unigene序列數;SSR分布的平均距離=序列總長度/搜索到的SSR數量。

2 結果與分析

2.1 青籬柴SSR數量與分布

由表1可知，利用MISA軟件對青籬柴轉錄組測序獲得的66 755條unigene進行檢索，共找到符合條件的SSR位點有22 542個，分布于18 972條unigene中。SSR發生頻率為28.42%，出現頻率為33.77%。其中含單個SSR位點的unigene有14 071條，含2個及2個以上SSR位點的unigene有4 901條。復合型SSR數量為1 573個。

由表2可知，青籬柴轉錄組SSR位點的種類非常豐富，從單堿基到六堿基重復均有分布，對1～6 bp的SSR重復基元類型進行統計可以看出，每個重復類型所含的數量相差很大。主要重復類型是單核苷酸，占SSR總數的47.59%，其次為三核苷酸和二核苷酸，分別占27.95%、23.45%，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復的數量極少，總計占1.01%，但類型很豐富，其中四核苷酸重復基序數量高于五核苷酸、六核苷酸。從分布情況看，相應的不同重復基序長度SSR分布的平均距離差距很大，其中單核苷酸重復最多，每條SSR分布平均距離為8.36 kb，其次為三核苷酸重復，每條SSR分布的平均距離為14.23 kb，六核苷酸重復最少，每條SSR分布的平均距離為6 900.21 kb，整體上青籬柴轉錄組中平均每 3 979 bp 就含有1個SSR位點。

2.2 青籬柴轉錄組SSR的特性

青籬柴轉錄組SSR位點的序列總長高達330 350 bp，平均每個SSR位點長度為15 bp，其中1～6 bp各核苷酸重復基元類型的SSR位點平均長度依次分別為13、16、17、21、25、36 bp。青籬柴轉錄組SSR位點的重復次數分布在5～24次之間，其中重復次數以10次最多，有5 013個，占總SSR數量的22.24%，其后依次是5、6、11、7次，分別占總SSR數量的16.71%、14.29%、9.54%、7.99%。不同類型SSR重復單元的重復次數分布存在差異，單核苷酸重復以10次重復為主;二核苷酸重復以6次重復為主;三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復均以5次重復為主。不同類型SSR重復單元均隨著重復次數的增加，位點數量呈遞減的趨勢。另外，隨著青籬柴轉錄組SSR位點的重復次數增多，單核苷酸重復類型所占比例越大。其中，重復次數在10次以上的SSR位點中，單核苷酸重復類型的SSR位點所占比例高達96.23%（圖1）。

在青籬柴轉錄組中的SSR位點長度分布于10～144 bp之間，長度為10～24 bp的重復序列最多，占99.78%;其次是25～42 bp的序列重復， 占0.19%; 大于43 bp的重復序列僅占0.03%（圖2）。

青籬柴轉錄組中共含有161種不同基序序列類型的SSR位點，從單核苷酸重復到六核苷酸重復依次有4、12、60、64、9、12種類型。從SSR位點重復單元出現頻率（表3）來看，單核苷酸重復中A/T重復基序類型占絕對的優勢，占總SSR位點數量的43.002%，二核苷酸重復中以AG/CT和AT/AT重復基序為主，分別占總SSR位點數量的16.605%、5.714%。在三核苷酸重復單元中以AAG/CTT基序類型最多，占總SSR位點數量的 10.692%，另外，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復基元類型因分布很少，包含的各重復基序類型出現頻率較低。

2.3 青籬柴轉錄組SSR引物設計

采用Primer 3.0引物批量設計程序對22 542個SSR位點的兩端序列進行引物設計，15 425條序列引物設計成功，成功率為68.43%。在設計成功的15 425對引物中，擴增產物為單堿基重復的最多，有7 482個，占48.51%;其次為三堿基和二堿基重復，分別占27.36%、17.73%。另外，PCR產物為復合型重復（含有一個以上SSR位點重復基元）的占5.34%（表4）。

2.3 青籬柴轉錄組SSR的可用性評價

鑒定分子標記可用性能的重要參考指標之一是其多態性，通常SSR長度是影響其多態性高低的重要因素，Temnykh等研究表明，SSR長度大于20 bp時具有高度多態性，長度在12～20 bp之間的SSR具有中度多態性，而長度在12 bp以下時多態性極低[18]。因此本研究對青籬柴轉錄組SSR位點進行搜索的篩選標準為單核苷酸重復至少10次，二核苷酸重復至少6次，三至六核苷酸重復至少5次。經統計發現，青籬柴轉錄組SSR的長度大多集中在12～45 bp之間，其中長度大于20 bp具有高度多態性的SSR共有1 739個，占總SSR的7.71%;長度在12～20 bp之間具有中度多態性的SSR共有14 756個，占總SSR的65.46%。另外，根據Zhang等的研究表明，高級重復單元類型的SSR多態性普遍比低級重復單元類型的低[19]。本試驗獲取的SSR主要是低級重復單元，如單核苷酸、三核苷酸、二核苷酸重復所占比例為87.27%，對青籬柴轉錄組SSR進行統計分析發現，長度大于20 bp的SSR全部屬于單核苷酸重復，共包含508個SSR位點，表明這部分青籬柴SSR具有高度多態性潛能，可以預計在青籬柴基因功能表達差異研究方面具有很好的利用價值。

3 討論與結論

目前高通量測序技術發展迅速、測序成本顯著降低，因此產生了大量的轉錄組測序數據，尤其是對于未知基因組序列的物種，其在轉錄組學中的研究越來越廣泛?；谵D錄組測序的SSR分子標記因其具有重復性好、等位差異多、多態性十分豐富、覆蓋面廣等優點，目前已廣泛應用于多種植物的品種選育和遺傳多樣性研究中。SSR廣泛分布于各種真核生物的基因組中，大約每隔10～50 kb就存在1個SSR。在植物中，平均23.3 kb就有1個SSR[20]。

本研究首次通過高通量測序技術得到青籬柴轉錄組數據信息，經過組裝與定位得到總計66 755條unigene，搜索到符合條件的SSR位點共計 22 542個，分布于18 972條unigene中，平均分布頻率為 1/3.98 kb，明顯高于云南松、菠菜、南方紅豆杉、燈盞花、洋蔥、藏茵陳、川西獐牙菜等[21-26]，略低于刺梨、藍靛果忍冬、菜薹等[27-28]。SSR位點出現頻率為33.77%，明顯高于紅松、魚腥草、印度南瓜、黨參、金釵石斛、莕菜、野三七、茄子等，低于杜仲、芙蓉李等[29-35]。造成不同物種SSR位點的出現頻率和平均分布頻率差異的原因可能與轉錄組數據中unigene數量及長度、SSR篩選的條件以及物種本身基因組差異等有關[36]。綜上說明青籬柴轉錄組中SSR重復位點數量相對而言比較豐富，可為SSR的開發提供重要的資源庫。

不同物種之間SSR主要重復類型有所差異，很多植物的SSR主要以二核苷酸、三核苷酸重復單元類型為主。本研究發現，青籬柴轉錄組SSR重復基元類型主要以單核苷酸為主，占全部SSR的47.59%，其次是三核苷酸，占全部SSR的27.95%。這與紅松、菜薹、茄子等相似，但與云南松、魚腥草、洋蔥、藏茵陳、刺梨等物種不同，這些植物中SSR的主要類型是三核苷酸重復。有研究表明，SSR的多態性與不同基序序列類型有一定關聯，SSR的重復基序類型中普遍存在A/T優勢。G/C重復基序類型在多數植物中很難見到，出現頻率都很低。原因可能是打破A/T堿基對之間的氫鍵所需的能量低于G/C堿基對之間的氫鍵，A/T的波動較G/C容易[36]。但也有觀點認為，由于甲基化的C殘基轉化為T及位于3′末端的polyA序列插入基因組后形成富含A的原始SSR，導致重復基序中A/T優勢的出現[37]，具體原因有待進一步研究分析。本研究也發現，青籬柴轉錄組SSR重復基序類型出現最多的是A/T，所占比例為43.002%。其次，AT/AT和AAT/ATT重復基序類型出現次數仍然很高，所占比例分別為5.714%、2.315%，表現出較明顯的A/T優勢。而G/C在所有重復基序類型中的出現頻率極低，C/G和CG/CG在單核苷酸和二核苷酸中所占的比例分別僅為4.845%、0.012%，這很好地驗證了上述觀點?？偟膩碇v，青籬柴轉錄組SSR不僅出現頻率高、平均分布頻率廣，且類型豐富，具有較高的多態性潛能和可用性。本研究明確了青籬柴轉錄組SSR位點的基本特征，其結果可為開發青籬柴SSR分子標記奠定基礎。與此同時，伴隨著青籬柴SSR分子標記的開發和利用，對于豐富青籬柴分子標記類型，加快青籬柴功能基因資源的開發利用，建立青籬柴種質資源評價和改良機制，對青籬柴進行遺傳結構、遺傳分化、居群動態和遺傳多樣性分析等具有重要意義。

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