植物乳桿菌對卷煙品質的影響

米其利 楊娟 徐玉瓊

摘要：為了提升煙葉品質，從中國傳統發酵食品酸蘿卜中分離篩選到1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）L15。將菌體懸液發酵煙絲以及對發酵產香條件進行優化，感官評吸結果表明，L15處理能有效提升煙葉的香氣，降低卷煙的雜氣、苦辣味和刺激性，改善余味，突顯酸香味;最佳產香條件為：接菌量1×109 CFU/mL、發酵溫度37 ℃、菌齡20 h，煙葉產地貴州福泉。發酵后煙絲主要化學成分比例更加平衡。致香成分分析表明，L15發酵使化合物數量從46個減少至42個，含量變化較大的化合物有乙酸、3-甲基丁醛和2-己酮。表明植物乳桿菌L15能有效改善煙葉的內在質量，提升卷煙抽吸品質。

關鍵詞：植物乳桿菌;陳化;卷煙品質;致香成分

中圖分類號： TS44+4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0177-04

煙葉陳化是在一定溫度和濕度條件下，煙葉理化特性發生深刻變化，煙葉香氣、色澤和吸味品質明顯改善的一個重要卷煙生產加工過程。煙葉陳化分為自然陳化和人工陳化。人工陳化速度快，但發酵后煙葉內各種成分比例不協調，至今已經很少采用。自然陳化發酵效果好，但耗時長，場地占用大，資金積壓多，導致生產成本提高。在煙葉的陳化過程中，微生物扮演著重要角色。Reid等率先發現，雪茄煙葉表面存在大量細菌、霉菌[1]。朱大恒等從中國烤煙煙葉中成功分離到大量微生物，包括占絕對優勢的細菌、少量放線菌和真菌[2]。目前，隨著高通量測序技術應用于煙草行業，陳化煙葉表面更多微生物種類得到了鑒定[3-4]。

煙葉表面存在的復雜微生物群落不僅可以加速煙葉發酵，還可以降低煙葉中有害成分，如煙堿、亞硝胺等[5-6]，以及改善和提高煙葉的吸食品質[7-9]，所以在煙葉陳化過程中添加外源微生物進行發酵，以便快速改善煙葉品質是煙草科技開發的重要課題。Izquierdo等在19世紀60—70年代發現，利用單種或多種微生物發酵煙葉，能使煙葉的香氣質得到顯著改善[10-11]。黃靜文等發現，經短小芽孢桿菌（Bacillus pumilum）發酵后的煙葉，煙香增加，刺激性降低，卷煙吸食味顯著改善[12]。陳興等發現，西姆芽孢桿菌（B. siamensis）能有效改善煙葉內在質量，提升卷煙抽吸品質[13]。此外，利用微生物發酵液改善煙葉品質和香氣的報道較多。李雪梅等利用微生物菌株Nic22的發酵上清液處理煙葉，結果表明，處理后卷煙的雜氣和刺激性減輕，抽吸品質顯著提高[14]。

乳酸菌是公認的食品級安全微生物，廣泛應用于酸奶、果汁、饅頭等食品的風味塑造。目前，用于煙葉發酵的微生物大多分離自煙葉表面或土壤，有些是條件致病菌[4]，存在一定的安全隱患。食源性有益菌用于煙葉發酵的報道不多，而利用乳酸菌改善煙葉品質的報道較少。甄達文等在制備煙用香料時發現，煙葉碎片經酶處理以后，用德氏乳酸菌（Lactobacillus debrueckii）和生香酵母組合發酵制得的香料，增香效果明顯[15]。潘家華等研究表明，由植物乳桿菌（L. plantarum）和醋酸桿菌（Clostriolium themoacidophilus）組成的復合微生物制劑發酵煙葉后，卷煙的陳化酸香和柔和細膩煙氣均增加，刺激性降低，吸食口感變好[16]。

本研究從中國傳統發酵食品酸蘿卜中篩選到1株植物乳桿菌，將其菌懸液用于煙葉發酵，優化其發酵產香條件，并檢測發酵對煙葉化學成分和致香成分的影響，為利用食品級乳酸菌改善煙葉品質，提升卷煙吸食質量及塑造新型風味卷煙等方面提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 煙葉 由云南中煙有限責任公司原料部提供，品種為K326，在倉庫中已自然陳化1年。

1.1.2 MRS培養基 蛋白胨10 g/L、牛肉粉8 g/L、酵母粉 4 g/L、葡萄糖20 g/L、吐溫80 1 mL/L、K2HPO4 2 g/L，NaAc 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO4 0.5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L，pH值6.2，滅菌條件為115 ℃，20 min。如需配成固體，在液體培養基中添加15 g/L瓊脂。

1.1.3 改良MRS固體培養基 MRS液體培養基中添加 10 g/L CaCO3、0.4 g/L溴甲酚紫和15 g/L瓊脂。

1.1.4 煙葉培養基 將1年陳化齡煙葉研磨成粉末，在 100 mL 培養基中加入0.8 g煙葉粉末和1.5 g瓊脂，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于篩選以煙葉為唯一營養源的乳酸菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離與鑒定 從湖南懷化采集酸蘿卜樣品若干份，利用改良MRS固體培養基篩選乳酸菌，單菌落保存在-80 ℃冰箱中。隨機選取6株乳酸菌，在煙葉培養基中劃線分離，37 ℃培養48 h。將長勢最好的1株乳酸菌在MRS固體培養基中培養48 h，觀察菌落形態，并按照常規細菌鑒定方法[17]進行生理生化特性分析。利用細菌基因組提取試劑盒（百泰克，中國）提取L15基因組DNA，用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增L15 16S rDNA基因，并送往昆明碩擎生物技術有限公司進行測序。PCR擴增條件為：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32個循環;72 ℃ 6 min。序列信息提交至NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行在線比對分析。綜合形態、生理生化和分子鑒定結果確定菌株身份。

1.2.2 菌株生長曲線和產酸曲線 從-80 ℃冰箱中取出菌株保藏液，按0.4%（體積比）接種至5 mL MRS液體培養基中進行活化。活化好的菌液按0.4%（體積比）接種于100 mL MRS液體培養基中，30 ℃靜止培養40 h。每隔2 h取4 mL菌液，用于D600 nm、pH值測定和活菌數分析。試驗重復3次。

1.2.3 煙絲發酵和發酵條件優化 用切絲機將煙葉切成煙絲，稱取含水率為12%的煙絲30 g，噴施6 mL濃度為1.0×109 CFU/mL、菌齡為20 h的乳酸菌菌懸液，對照樣品噴施等量無菌水。將處理后的煙絲和對照裝入無菌食品袋中，于溫度為37 ℃、60%恒溫恒濕培養箱中發酵7 d。然后，將煙絲制成卷煙，用于后續感官評吸。為獲得最佳發酵條件，基于感官評吸，通過正交試驗進行優化。

1.2.4 感官評吸 將發酵卷煙和對照隨機編號，在恒溫恒濕培養箱中平衡24 h后，由6名專家進行評吸。卷煙感官質量用香氣質、香氣量、濃度、勁頭、刺激性、余味、雜氣量、燃燒性和灰色等9個指標進行評價，得分越高，抽吸品質越好。每個樣品重復評吸3次。

1.2.5 主要常規化學成分測定 采用連續流動分析法，參考行業標準YC/T 159—2002、YC/T 468—2013、YC/T 468—2013，分別測定總糖含量、還原糖含量、總氮含量、總植物堿含量。

1.2.6 揮發性成分分析 利用頂空-固相微萃取技術分離揮發性化合物，每次萃取的煙樣為0.5 g，溫度為60 ℃，時間為40 min。氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAXetr型毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）（Agilent，美國）;程序升溫為初始溫度60 ℃，保持5 min，第1階升溫速率2 ℃/min，終溫 200 ℃，第2階升溫速率10 ℃/min，終溫240 ℃，保持 10 min;進樣口溫度180 ℃;載氣為高純氦氣;恒流模式，柱流量1.5 mL/min，分流比10 ∶ 1。質譜條件：電離方式為電子轟擊源;電離能量70 eV;傳輸線溫度180 ℃;離子源溫度 200 ℃;溶劑延遲4 min;質量范圍33～400 amu。對采集到的質譜圖利用Wiley和NIST譜庫進行串聯檢索，確定化合物身份，并利用峰面積歸一化法計算各化學成分在樣品中的相對含量。

1.3 數據分析

采用SPSS 22軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌篩選和鑒定

在改良MRS固體平板上，菌落顏色為乳白色或淡黃色，菌落周圍有明顯溶鈣圈，溴甲酚紫變為黃色，這些單菌落初步確定為乳酸菌。在6株乳酸菌中，4株能在煙葉固體培養基上生長，將長勢最好1株命名為L15，作為后續試驗菌株。L15菌落形態規則，淡黃色，表面光滑、邊緣整齊;菌株顯微形態為短桿狀、無鞭毛。生理生化測定結果見表1。分子生物學鑒定結果顯示，L15與L. plantarum 16S rDNA序列具有>99%同源性。形態、生理生化和分子鑒定結果表明，L15為植物乳桿菌。

2.2 菌株L15生長和產酸特性

生長曲線分析顯示，L15從4 h進入對數生長期，在18 h進入穩定生長期，30 h后菌落數和D600 nm值開始下降，推測其可能開始進入衰亡期（圖1）。產酸曲線分析發現，在最初接菌到對數生長初期pH值維持6左右，然后在對數期急劇下降，最后從對數生長期末期到衰亡期維持在3.4～3.5（圖1），說明L15具有很強的產酸能力。

2.3 感官評吸

按照試驗方法所述進行感官評吸，試驗結果，L15處理能顯著改善卷煙吸食品質，表現為對照樣品的煙氣質粗糙，雜氣大，刺激感凸顯，余味苦辣，化學味較強，而L15發酵卷煙的香氣質提升，煙氣柔和，雜氣、刺激性和苦辣味減輕，酸香味凸顯，余味改善。在總評分為50分情況下，發酵卷煙的分值為32.39分，明顯高于對照的29.33分。

2.4 產香發酵條件優化

基于感官評吸，對L15發酵條件進行優化。選取接菌量、發酵溫度、菌齡、煙葉產地4個因素進行正交試驗[L8（3×23）]（表2）。正交試驗結果見表3。從表3可以看出，接菌量為1×109 CFU/mL、發酵溫度為37 ℃、菌齡為20 h、煙葉產地為貴州福泉時，發酵卷煙的感官評吸值最高，分別比未優化和對照高0.42、3.48分，表明A2B2C2D2組合為L15的最適產香發酵條件。

2.5 煙絲主要常規化學成分分析

經L15處理后，煙絲中的總氮含量、總植物堿含量變化不明顯，但總糖含量極顯著降低，總還原糖含量顯著減少，導致糖氮比由10.11降低至9.29，糖堿比由9.16降低至8.63（表4）。

2.6 致香成分分析

從表5可以看出，L15發酵卷煙致香成分的種類主要包括酸、酮、醛、醇等4個大類，它們的含量均超過了10%。從化合物的種類來看，對照樣品共鑒定出46個揮發性化合物，包括4個酸、13個酮、9個醛、8個醇、2個酯、2個烯、2個苯、2個呋喃、4個其他揮發性化合物，L15發酵卷煙對應揮發性化合物數量分別為5個酸、14個酮、9個醛、6個醇、1個酯、烯和苯為0、2個呋喃和5個其他揮發性化合物。從化合物的含量來看，總酸、總醇和總酯含量增加，總醛、總酮、總烯、總苯和總呋喃含量減少;含量較多且變化很明顯的化合物有乙酸、3-甲基丁醛和2-己酮，其中乙酸含量增加了18.5百分點，3-甲基丁醛含量減少了10.96百分點，2-己酮從7.33%減少為0。另外，有些化合物，例如丙酸、5-甲基呋喃醛、2-甲基呋喃等，它們的含量雖然較少，但處理與對照煙樣間存在顯著性差異。這些化合物的改變可能是L15改善煙葉吸食品質的主要原因。

3 討論與結論

在煙葉陳化過程中，添加外源微生物進行發酵，能減輕卷煙雜氣和刺激性，提高吃香味，改善煙葉品質[9-11，17]。本研究結果，即植物乳桿菌L15發酵處理后的卷煙，香氣質提升，煙氣柔和，雜氣、刺激性和苦辣味減弱，酸香味凸顯，余味改善，說明植物乳桿菌能改善煙葉吸食品質。由于乳酸菌的安全性，利用乳酸菌塑造特征風格卷煙潛力巨大。

煙葉化學成分是卷煙吸食味的物質基礎。微生物發酵會加速煙葉化學成分變化，縮短陳化時間。瞿嬌嬌等發現，食源性芽孢桿菌能明顯改善煙葉品質，發酵處理后煙葉的總糖含量、糖氮比、糖堿比均下降[18]，本研究結果與其高度相似。由于乳酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌，L15處理造成總糖含量、總還原糖含量減低應該歸因于L15發酵產酸。L15發酵引起主要化合物含量的改變，可能使煙葉的糖、氮和堿等比值更趨于平衡，促進煙葉品質改善。

通過發酵，煙絲中致香物質種類由46個減少至42個，這些含量從無到有或從有到無的化合物，除了2-己酮外，含量均很少。發酵后煙絲的總酸含量尤其是乙酸含量、總醇含量和總酯含量增加，總醛含量尤其是3-甲基丁醛含量、總酮含量尤其是2-己酮含量、總烯含量、總苯含量、總呋喃含量減少，說明在L15的作用下，煙葉中的化合物可能進行了相互轉化。酸類致香物質能去除雜氣，改善口感，減輕刺激，醇類致香物質使卷煙香氣細膩，酯類致香物質能掩蓋焦苦氣息，改善煙氣吸味[19-20]。這些致香物質含量變化可能是L15發酵卷煙吸食品味高于對照的重要原因之一。但煙葉品質的高低是多種因素綜合作用的結果，L15改善卷煙品質的機制還需要進一步研究闡明。

參考文獻：

[1]Reid J J，Haley E E. Studies on the fermentation of tobacco Ⅰ. The microflora of cured and fermenting cigar-leaf tobacco[J]. Pennsylvania Agricultural Experiment Station Bulletin，1933，356：1-17.

[2]朱大恒，陳 銳，陳再根，等. 烤煙自然醇化與人工發酵過程中微生物變化及其與酶活性關系的研究[J]. 中國煙草學報，2001，7（2）：26-30.

[3]Ye J，Yan J，Zhang Z，et al. The effects of threshing and redrying on bacterial communities that inhabit the surface of tobacco leaves[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2017，101（10）：4279-4287.

[4]Chopyk J，Chattopadhyay S，Kulkarni P，et al. Mentholation affects? the cigarette microbiota by selecting for bacteria resistant to harsh environmental conditions and selecting against potential bacterial pathogens[J]. Microbiome，2017，5（1）：22.

[5]Gong X W，Yang J K，Duan Y Q，et al. Isolation and characterization of Rhodococcus sp. Y22 and its potential application to tobacco processing[J]. Research in Microbiology，2009，160（3）：200-204.

[6]Wei X，Deng X，Cai D，et al. Decreased tobacco-specific nitrosamines by microbial treatment with Bacillus amyloliquefaciens DA9 during the air-curing process of burley tobacco[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（52）：12701-12706.

[7]Maldonado-Robledo G，Rodriguez-Bustamante E，Sanchez-Contreras A，et al. Production of tobacco aroma from lutein. Specific role of the microorganisms involved in the process[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2003，62（5/6）：484-488.

[8]Rodríguez-Bustamante E，Maldonado-Robledo G，Ortiz M A，et al. Bioconversion of lutein using a microbial mixture-maximizing the production of tobacco aroma compounds by manipulation of culture medium[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，68（2）：174-182.

[9]趙銘欽，李曉強. 煙葉微生物發酵機理及生物制劑應用研究進展[J]. 甘肅農業大學學報，2007，42（6）：84-91.

[10]Izquierdo T A. Bacteria in tobacco fermentation[J]. Coresta，1958（2）：2146.

[11]English C F，Bell E J，Berger A J. Isolation of thermophiles from broadleaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness[J]. Applied Microbiology，1967，15（1）：117-119.

[12]黃靜文，段焰青，者 為，等. 短小芽孢桿菌改善煙葉品質的研究[J]. 煙草科技，2010，43（8）：61-64.

[13]陳 興，張天棟，黨立志，等. 利用西姆芽孢桿菌改善煙葉品質的研究[J]. 云南農業大學學報（自然科學版），2016，30（2）： ?322-327.

[14]李雪梅，楊偉祖，祝明亮，等. 煙堿降解菌的選育及改善上部煙葉品質研究[J]. 工業微生物，2006，36（1）：16-22.

[15]甄達文，于鐵妹，朱珊珊，等. 利用酶法與微生物發酵法制備天然煙用香料[J]. 食品工業科技，2009，30（12）：268-272.

[16]潘家華，黃 龍，龐登紅. 加速煙葉陳化和提升煙葉品質的復合微生物制劑及其應用：CN103202533A[P]. 2013-07-17.

[17]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[18]瞿嬌嬌，施 鳴，張慶明，等. 食品微生物對發酵煙葉品質的影響[J]. 貴州農業科學，2012，40（3）：136-138.

[19]黃靜文，段焰青，楊金奎，等. 煙葉主要致香成分和煙葉等級以及醇化時間的對比分析[J]. 江西農業大學學報，2010，32（3）：440-445.

[20]王 濤，張 強，吳雨松，等. 云南省煙梗微波膨脹后致香物質差異性分析[J]. 湖北農業科學，2017，56（14）：2694-2699.