4種方法檢測8個菊花品種花粉活力的比較

涂清芳 賈雪晴 姜自紅

摘要：花粉活力是雜交育種能否成功的決定因素之一。研究4種方法測定8個菊花品種的花粉活力。結果表明，8個菊花品種中，遲黃花粉活力最高，其次為杭白菊，再次為黃山貢菊和白/黃香梨，然后為滁菊和亳菊;白金菊花粉活力較低，金絲皇菊花粉活力最低，部分品種間花粉活力存在顯著差異（P<0.05）;對于滁菊和杭白菊，3種快速測定法中，I2-KI法的測定值更接近離體萌發法，而關于I2-KI法是否為菊花花粉快速測定的最佳方法，仍需進一步試驗。

關鍵詞：菊花;花粉活力;測定方法

中圖分類號： S682.1+10.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0109-03

菊花[Dendranthema morifolium （Ramat. ）Tzvel.]是中國的傳統名花，其觀賞價值高，歷來受到中國文人雅士的推崇和百姓的喜愛。隨著育種技術的發展，現在已有數千個園藝品種，應用方式多種多樣，更是產生了較高的經濟價值和社會效益。在菊花的眾多育種方法中，雜交育種是最基本、最常用、最簡單且最有成效的方法[1-4]。授粉是影響雜交育種結實率的重要因素[5]。花粉是被子植物的雄配子體，在植物的有性繁育過程中發揮著重要作用。父本具有良好的花粉活力是菊花成功進行雜交育種的重要條件。本試驗通過運用多種花粉活力快速測定法和離體萌發法測定8個菊花品種（或變種）的花粉活力，以初步判斷其花粉細胞活性，為菊花雜交育種組合方案的制定提供參考依據，同時還可比較不同花粉活力測定方法的優劣，為菊花花粉活力測定方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料編號、品種及材料來源見表1，主要來自南京農業大學的資源圃。2017年11月正值各品種菊花盛花期間，選擇晴天的上午采集各品種盛開的花序，帶回實驗室取花粉進行試驗。

1.2 試驗時間和地點

所有試驗選擇在2017年11月15—21日期間，正值菊花的盛花期，在滁州職業技術學院志勤樓2202實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 快速測定花粉活力

1.3.1.1 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法 稱取0.03 g TTC 溶解在10 mL磷酸鹽緩沖溶液中， 置于棕色試劑瓶中待用。將1～2滴TTC溶液滴于凹面載玻片的凹陷處，取新鮮花粉散置其中，蓋上蓋玻片。然后放于35 ℃恒溫箱中，染色20 min左右，進行鏡檢，有生活力的花粉粒呈紅色，有微弱活力的花粉粒呈淡紅色，無活力或不育的花粉無色[6]。每個品種做3個玻片，每個玻片取5個固定大小的視野進行統計，每個視野中的花粉粒數不少于50粒。花粉活力=被染為紅色的花粉數量/總花粉粒數量×100%。

1.3.1.2 醋酸洋紅染色法 配制1%醋酸洋紅溶液，置于棕色試劑瓶中待用。取少量新鮮花粉置于凹面載玻片凹陷處，滴1～2滴醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片，染色5～10 min，鏡檢，呈深紅色的花粉粒有生活力，呈淡紅色的則無生活力[7]。同樣，每個品種做3個玻片，每個玻片取5個視野進行統計。

1.3.1.3 I2-KI染色法 配置2% I2-KI溶液，置于棕色試劑瓶中待用。取少量新鮮花粉置于凹面載玻片凹陷處，滴2滴I2-KI溶液染色，5 min后在顯微鏡下觀察。同樣，每品種做3個玻片，每個玻片取5個視野進行統計。有生活力的花粉呈藍色，生活力衰弱的花粉或內含物少的花粉呈黃褐色。花粉活力=藍色花粉數量/總花粉數量×100%[8]。

1.3.2 離體萌發法測定花粉活力 配制配方為100 g/L蔗糖+50 mg/L 硼酸+30 mg/L CaCl2+7 g/L瓊脂+200 g/L PEG4000的固體培養基，在凝固前用移液槍移取100～150 μL 滴于凹玻片凹陷處，取花粉散置于培養基上，然后放入底部有潮濕濾紙的培養皿中，在20 ℃黑暗條件下培養2 h以上。在顯微鏡下檢測花粉萌發情況[9]。花粉管長度大于花粉直徑視為花粉粒萌發標準，否則視為不萌發[10]。萌發 率= 萌發的花粉數量/檢測的花粉粒總數量×100%。

1.3.3 花粉活力測定方法比較 相對于各種花粉活力快速測定法，花粉離體萌發法的測定結果更接近真實情況。故以花粉萌發法為依據，比較TTC法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法的測定值，以確定適于菊花花粉活力的快速測定方法[11]。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，每次重復統計5個視野，所得試驗數據采用Excel 2003和SPSS 20.0軟件進行處理[12]。

2 結果與分析

2.1 TTC法測定8個菊花品種的花粉活力比較

用TTC法檢測8個菊花品種的花粉活力，花粉被染成紅色和淡紅色，仔細觀察使能區分是否有活力。花粉活力排名前3位的品種分別是遲黃、杭白菊和滁菊，活力排名最后2位的是白金菊和金絲皇菊（表2）。經方差分析，其中杭白菊與滁菊差異不大，差異沒有統計學意義（P>0.05）;白/黃香梨與滁菊差異不大，差異沒有統計學意義（P>0.05）;亳菊與黃山貢菊差異不大，差異沒有統計學意義（P>0.05）。除此之外，其他品種的花粉活力兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 醋酸洋紅染色法測定8個菊花品種的花粉活力比較

用醋酸洋紅染色法檢測8個菊花品種的花粉活力，花粉基本被染成深紅色，極少為淺紅色，花粉活力明顯偏高，其中遲黃、黃山貢菊和滁菊的花粉活力高達100.0%。而活力排名最后的金絲皇菊，花粉活力也高于90.0%。經方差分析，其中白金菊、白/黃香梨、杭白菊、滁菊、黃山貢菊、遲黃6個品種的花粉活力兩兩比較差異均無統計學意義（P>0.05）（表3）。

2.3 I2-KI染色法測定8個菊花品種的花粉活力比較

用I2-KI法檢測8個菊花品種的花粉活力，染色結果比較清晰，藍色和黃褐色的花粉容易區分。花粉活力排名前3位的分別是杭白菊、遲黃和黃山貢菊，活力排名最后2位的是白金菊和金絲皇菊（表4）。經方差分析，其中滁菊、白/黃香梨、黃山貢菊3個品種的花粉活力兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）;遲黃和杭白菊比較差異無統計學意義（P>0.05）;除此之外， 其他品種的花粉活力兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.4 離體萌發法測定8個菊花品種的花粉活力比較

用離體萌發法檢測8個菊花品種的花粉活力，萌發花粉管的花粉數量不多，整體花粉活力較快速檢測法的測定值低，其中排名前3位的是遲黃、白/黃香梨和杭白菊，排名最后2位的是白金菊和金絲皇菊（表5）。經方差分析，其中杭白菊、白/黃香梨、黃山貢菊3個品種的花粉活力兩兩比較差異均無統計學意義（P>0.05）;滁菊和黃山貢菊比較差異無統計學意義（P>0.05）;亳菊和白金菊比較差異無統計學意義（P>0.05）;除此之外，其他品種的花粉活力兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

4種方法測定8個菊花品種的花粉活力比較結果見圖1。其中，不同染色方法對菊花品種花粉活力的測定效果見圖2。

2.5 3種快速測定花粉活力方法的比較

3種快速測定花粉活力的方法簡便易行，但準確度不高，而離體萌發法測定花粉活力更接近真實結果。由于醋酸洋紅法檢測花粉活力，測定值普遍很高，明顯失真，首先將其排除。因此，以滁菊、杭白菊、亳菊3個菊花品種為例，以離體萌發法的測定值為參照，將TTC法、I2-KI染色法快速測定花粉活力的測定值和其進行比較，以選出適宜菊花的花粉活力快速測定的方法。因數據不具有方差齊性，選擇Dunnetts T3進行兩兩分析的比較，結果見表6。

由方差分析可得，F滁菊=344.68，F杭白菊=502.47，F亳菊=323.65，P<0.001。進一步進行Dunnetts T3檢驗，亳菊的TCC法與I2-KI法檢測所得花粉活力之間無顯著性差異，無統計學意義。滁菊和杭白菊的TCC法與I2-KI法、TCC法與離體萌發法、I2-KI與離體萌發法檢測結果之間均具有統計學意義，存在顯著性差異（P<0.05）。根據表6的數據，可以在一定程度上認為，滁菊和杭白菊在花粉活力的快速檢測方法上，I2-KI法的測定值更接近離體萌發法。

3 討論與結論

3.1 8個菊花品種的花粉活力比較

4種方法測定的8個菊花品種的花粉活力值各不相同，其中遲黃在3種方法中排序第1，在另一種方法中排序第2;杭白菊在4種方法中均排序前4;黃山貢菊和白/黃香梨在3種方法中均排序前4;白金菊在3種方法中均排序第7;金絲皇菊在4種方法中均排序第8。因此，整體比較可認為，8個菊花品種中，遲黃的花粉活力最高，其次為杭白菊，再次為黃山貢菊和白/黃香梨，然后為滁菊和亳菊，金絲皇菊的花粉活力最低，且和其他品種均有顯著性差異，另外，白金菊的花粉活力也較低。從理論上講，花粉活力較低的金絲皇菊和白金菊不適宜選作雜交育種的父本。在本試驗中，金絲皇菊和白金菊測得的花粉活力較低。從形態上看，金絲皇菊的花粉量少，白金菊的花粉被花被包圍不易取，取花粉時這2個品種的花粉更容易受操作及外界影響。這在一定程度上也許會影響花粉活力，但尚屬推論，需要進一步試驗。

3.2 花粉活力測定方法的比較

首先，離體萌發法測定菊花花粉活力比快速測定法的結果更真實。而3種快速測定花粉活力方法的測定值均偏高，并不能反映花粉本身的可育性和受精力。其中，醋酸洋紅法的測定值過高，參考價值不大。將滁菊、杭白菊、亳菊的TCC法、I2-KI法與離體萌發法測定的花粉活力，通過Dunnetts T3進行兩兩比較和檢驗，對于滁菊、杭白菊來說，可以認為3種方法中，I2-KI法的測定值更接近離體萌發法。而對于亳菊來說，尚不能得出這個結論。

另外，快速測定花粉活力的方法還有MTT染色法、聯苯胺染色法等，因此關于I2-KI是否確實為菊花快速測定花粉活力方法中更接近離體萌發法的方法，仍需要進一步驗證。

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