4個早熟梨品種葉片對黑斑病的抗病性評價及與抗氧化酶的關系

王宏 馬娜 藺經

摘要：對翠冠、蘇翠1號、華酥和七月酥等4個梨品種，接種黑斑病菌，評價不同品種的發病率、發病程度、病斑生長速度。通過分析比較葉片中超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）、超氧化物歧化酶 （SOD） 、過氧化氫（H2O2）、過氧化氫酶 （CAT）的活性變化，探討不同梨品種的抗病機制。結果表明，4個品種中，翠冠和蘇翠1號較抗病，華酥、七月酥較感病。接種病原菌引起翠冠和蘇翠1號梨葉片 O-2 · ?和H2O2活性升高，同時抗氧化酶SOD和CAT活性也上升;華酥葉片 O-2 · ?和SOD活性升高，但是CAT含量降低;而七月酥無論是活性氧或解毒酶含量均下降。表明活性氧信號參與了翠冠、蘇翠1號和華酥對黑斑病的響應，而CAT作為解毒酶，參與了翠冠和蘇翠1號對黑斑病的抗性響應。

關鍵詞：梨;黑斑病;抗病性;活性氧;抗氧化酶

中圖分類號： S436.612.1+4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0080-03

梨黑斑病是梨主要病害之一，由絲孢綱絲孢目鏈格孢屬真菌[Alternaria alternata （Fr） Keissler]引起[1-2]。病原菌侵染葉片、果實、新稍，在病葉、病梢及病果上越冬[1]。來年春天，病部產生分生孢子，借風雨傳播，進行初次侵染[1]。雨季，病原菌孢子迅速擴散，在1～2周內，60%～80%的葉片即可發病[1]，對梨產業造成嚴重的經濟損失，制約了梨產業的發展。

國內外對該病的防治有大量研究，目前防治該病的主要方法仍然是化學防治[2]。化學藥劑的使用存在潛在的危害，會造成污染環境，影響人體健康，長期使用還會引起病原菌對化學藥劑的抗藥性等。提高梨樹抗病能力是擴大梨果產量和改善梨果品質的關鍵。梨黑斑病菌是一種死體營養型病原真菌[3]。在長期的植物病原菌互作中，植物自身形成了多種防御機制，抵御了黑斑病菌的侵染[3]。研究砂梨不同品種對黑斑病的防御機制，為梨黑斑病的合理防治及砂梨抗黑斑病的分子育種奠定理論基礎。

本研究室選育的蘇翠1號以早熟梨華酥為母本，翠冠為父本雜交選育而成，該品種果實成熟早、品質優、外觀好 [4]，目前在生產中進行推廣和應用。其對黑斑病的抗病性和抗病機理未有系統報道。本試驗對包括翠冠、蘇翠1號、華酥在內的4個梨品種接種黑斑病病原菌，調查了葉片發病情況及感病期間活性氧[超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）和過氧化氫（H2O2）]及活性氧清除酶[超氧化物歧化酶（SOD） 和過氧化氫酶（CAT）]的活性，為實際生產中梨黑斑病的合理防治和砂梨抗黑斑病育種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗時間地點

試驗于2017年在江蘇省農業科學院果樹所梨研究室實驗室進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試梨品種 翠冠、蘇翠1號、華酥、七月酥，均來源于江蘇省農業科學院梨種質資源圃。

1.2.2 供試菌株 黑斑病病原菌[Alternaria alternata （Fr） Keissler]，來源于江蘇省農業科學院植保所劉鳳權老師研究室[5]。

1.3 接種方法

黑斑病病原菌接種在土豆瓊脂培養基上，16 h（25 ℃）/8 h（22 ℃）光周期培養4 周后，收集病原菌孢子，將孢子懸浮液濃度稀釋為1.0×106 個孢子/mL用于接種葉片[3]。取生長4周的植株頂部往下第4 張葉片，將葉片正面向上放入0.6%的瓊脂培養基上，無菌針刺穿葉片表面，接種病原菌[3]。處理和對照各80張葉片，并平均分作2組，一組用于接種病原菌，每張葉片接種2滴 10 μL 孢子懸浮液，另一組只接種無菌水。葉片接種后置于25 ℃暗培養，每天觀察葉片發病情況，以發病率（發病葉片占總接種葉片的比例）和病斑直徑作為衡量發病程度的指標[3]。

1.4 檢測項目及方法

活性氧自由基、SOD、H2O2及CAT的活性測定均采用江蘇南京建成生物工程研究所響應的試劑盒，試劑盒編號分別為A052、A001-1-1、A064、A007-1-1[3]。

2 結果與分析

2.1 4個梨品種葉片黑斑病發病差異

葉片在接種后2 d形成病斑，4個品種中，翠冠和蘇翠1號發病程度較輕，其次是華酥，發病最重的為七月酥（圖1-A）。接種病原菌后2 d，翠冠的發病率為25%，華酥為80%，七月酥為83.3%。隨著接種時間延長，翠冠葉片上的發病率逐漸上升，到接種后7 d為75%。接種后3～5 d，蘇翠1號發病率為75%;接種接種后6 d達到了100%。接種后 3 d，華酥的發病率達到了100%。七月酥在接種后接種后 3～5 d的發病率仍為83.3%，接種后6 d達到了100%（圖1-B）。4個品種上病斑每日平均生長速率不同。日平均生長速率分別為翠冠 1.43 mm/d，蘇翠1號1.50 mm/d，華酥 1.79 mm/d，七月酥2.19 mm/d。

2.2 超氧陰離子自由基活性的變化

接種病原菌后，翠冠、蘇翠1號、華酥和七月酥的 O-2 · ?活性都受到不同程度的影響（圖2）。在接種后3 d，前3個品種的 O-2 · ?活性都高于未接種時，接種后5 d， O-2 · ?活性下降。接種后，七月酥的 O-2 · ?活性下降。

2.3 SOD活性的變化

接種病原菌后，翠冠、蘇翠1號、華酥和七月酥的SOD活性都受到不同程度的影響（圖3）。在接種后3 d，前3個品種的SOD活性都高于未接種時，接種后5 d，SOD活性下降。接種后，七月酥的SOD活性下降。

2.4 H2O2活性的變化

與接種前比較，接種病原菌后 3 d，翠冠和蘇翠1號的H2O2活性上升，而華酥和七月酥的H2O2活性下降（圖4）。在接種后5 d，4個品種的H2O2活性均下降。

2.5 CAT活性的變化

與接種前比較，接種病原菌后，翠冠和蘇翠1號的CAT活性上升，而華酥和七月酥的CAT活性下降（圖5）。

3 討論與結論

梨黑斑病是梨樹主要病害之一，在我國各梨產區均有發生，尤其在南方夏季多雨時，梨園樹體發病嚴重[1]，造成較大的經濟損失，并在梨進出口貿易中受到進口國的嚴密關注[1]。防治梨黑斑病的關鍵是抗病育種，鑒定梨種質資源對黑斑病的抗性是培育新品種的關鍵。蘇翠1號為本研究室培育的新品種，因其成熟早，品質憂，外觀好[4]，在生產中推廣應用后受到廣泛好評。但是其對黑斑病的抗性未有系統報道。本試驗用其母本華酥、父本翠冠以及七月酥作為對照品種，調查了離體條件下，4個品種梨葉片對黑斑病的抗性，并分析了抗病機制。結果表明4個早熟品種中，翠冠和蘇翠1號較抗病，其次是華酥，七月酥最感病。

在植物與死體營養型病原菌互作中，病原菌一般通過分泌多種毒力因子，調節宿主響應（如植物激素、活性氧（ROS）等激活細胞壞死）來實現定植蔓延[6]。ROS作為一種信號分子誘導抗性反應，促進細胞壞死，并且具有抗菌活性[7]。ROS以 O-2 · ?和H2O2的形式存在。SOD催化 O-2 · ?形成H2O2[8] ，胞外形成的H2O2進入細胞內，引起細胞程序性死亡[9]。死體營養型病原菌從壞死的組織吸取營養，從而大量擴展[9]。CAT作為解毒酶，把H2O2分解為H2O和O2[8]。研究表明，CAT突變體表現出了H2O2誘導的細胞死亡癥狀[10]。很多研究也證實，對于死體營養型病原菌，植物產生的ROS毒性的大小直接取決于植物產生的超氧化物和過氧化氫的濃度[9]。本試驗比較了接種黑斑病病原菌后，4個品種的活性氧和抗氧化酶的活性。接種早期，翠冠和蘇翠1號的 O-2 · ?、SOD、H2O2和CAT的活性較高，而華酥和七月酥上 O-2 · ?、SOD、H2O2和CAT的活性下降。表明病原菌觸發了翠冠和蘇翠1號產生ROS，而較高的CAT含量表明CAT參與H2O2的解毒，抑制了H2O2引起的細胞死亡，從而提高了這2個品種的抗病性。

參考文獻：

[1]王 宏. 梨黑斑病菌（Alternaria alternata Japanese pear pathotype）生物學特性及生物-化學協同防治技術的研究[D]. 南京：南京農業大學，2003：1-6.

[2]楊曉平.梨黑斑病菌鑒定及砂梨抗黑斑病分子機制探討[D]. 武漢：武漢大學，2015：1-10.

[3]Wang H，Lin J，Chang Y，et al. Comparative transcriptomic analysis reveals that ethylene/H2O2-mediated hypersensitive response and programmed cell death determine the compatible interaction of sand pear and Alternaria alternate[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：195.

[4]藺 經，盛寶龍，李曉剛，等. 早熟砂梨新品種‘蘇翠1號[J]. 果農之友，2013，40（11）：7-8.

[5]楊曉蕾，錢國良，范加勤，等. 梨黑斑病菌拮抗細菌的篩選鑒定及其拮抗活性的研究[J]. 南京農業大學學報，2014，37（1）：68-74.

[6]Takeshi S，Tomoko S，Yoshihiro N，et al. Ultrastructural localization of hydrogen peroxide in host leaves treated with AK-toxin Ⅰ produced by Alternaria alternate Japanese pear pathotype[J]. Journal of General Plant Pathology，2002，68（1）：38-45.

[7]Rossi F R，Gárriz A，Marina M，et al. The sesquiterpene botrydial produced by Botrytis cinerea induces the hypersensitive response on plant tissues and its action is modulated by salicylic acid and jasmonic acid signaling[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2011，24（8）：888-896.

[8]Bestwick C S，Brown I R，Bennett M H，et al. Localization of Hydrogen peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola[J]. Plant Cell，1997，9（2）：209-221.

[9]Govrin E M，Levine A. The hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea[J]. Current Biology，2000，10（13）：751-757.

[10]Greenberg J T，Yao N. The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen interactions[J]. Cellular Microbiology，2004，6（3）：201-211.