基于SSR標(biāo)記的同一花序貴州野生白三葉遺傳多樣性分析

李莉 吳永潔 王元素

摘要：采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)19份分別來(lái)源于同一花序的貴州野生白三葉樣品進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究。結(jié)果表明，利用20對(duì)引物共擴(kuò)增出207個(gè)條帶，其中178個(gè)條帶具有多態(tài)性。20對(duì)引物多態(tài)性位點(diǎn)的比例為76.92%～92.31%，平均多態(tài)性為85.99%。20對(duì)引物對(duì)19份白三葉材料SSR的PCR擴(kuò)增條帶的多態(tài)信息含量為 0.380 6～0.499 7，平均為0.463 2。在相似系數(shù)為0.60時(shí)，把19份白三葉材料劃分為3大類。第1類是W18，最早被分開(kāi)獨(dú)立成一類，從SSR標(biāo)記來(lái)看，W18與其余材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。第2類包括W2和W13，表明這2個(gè)居群間親緣關(guān)系較近，遺傳差異不大。第3類為剩下的16個(gè)品種，居群間的遺傳關(guān)系較復(fù)雜。

關(guān)鍵詞：貴州;野生白三葉;同一花序;遺傳多樣性;SSR

中圖分類號(hào)： S541+.903.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0049-05

植物在進(jìn)化過(guò)程中，形成了適應(yīng)外界環(huán)境變化的功能性狀[1]，但研究表明，植物遺傳背景是植物功能性狀變異的主要來(lái)源之一，甚至大于環(huán)境因素的影響[2]。張莉等研究也提出研究植物性狀對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)，必須明確遺傳背景與環(huán)境對(duì)植物性狀的相對(duì)影響，以排除遺傳背景的作用[3]。

在植物不同花或花序之間存在不同程度的繁殖資源分配和競(jìng)爭(zhēng)問(wèn)題，即植株不同部位的花甚至是同一個(gè)花序內(nèi)不同部位花的地位是不平等的，存在明顯的位置效應(yīng)[4]，導(dǎo)致同株植物甚至同一花序不同位置的小花、果實(shí)和種子的數(shù)量、大小、形態(tài)及繁殖效率可能存在差異[5]。張鶴山等研究表明，不同取樣地紅三葉的單株花序數(shù)和單個(gè)花序小花數(shù)的變異是體現(xiàn)多樣性的重要指標(biāo)[6]。劉左軍等統(tǒng)計(jì)不同部位頭狀花序的生物量投入，并分析了存在于總狀花序內(nèi)資源分配上的結(jié)構(gòu)效應(yīng)及其對(duì)不同生境條件的反應(yīng)[4]。

白三葉是多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，為異花授粉植物，廣泛分布于世界各地，在畜牧業(yè)發(fā)展中起重要作用。吳永潔等采用溫室大棚培養(yǎng)，用來(lái)源于同一花序的白三葉作為試驗(yàn)材料，研究貴州野生白三葉的形態(tài)多樣性，以排除環(huán)境因素對(duì)試驗(yàn)的影響，在同一花序水平上研究形態(tài)多樣性，可以減少基因漂移和花粉污染等因素的影響，為進(jìn)一步研究其遺傳水平上的多樣性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[7]。目前簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）已被廣泛應(yīng)用于各種研究，如遺傳多樣性分析[8]、種質(zhì)分子身份證的構(gòu)建[9]、遺傳連鎖圖繪制及QTL定位[10]、目標(biāo)性狀基因定位和分子標(biāo)記輔助育種[11]等。本研究以貴州省境內(nèi)19份野生白三葉種質(zhì)為研究對(duì)象，比較同一花序水平上的遺傳多樣性，可為下一步選育優(yōu)質(zhì)高效白三葉新品種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 2013年5—8月在貴州省范圍內(nèi)收集野生白三葉種子，共收集19份種質(zhì)，具體收集地點(diǎn)見(jiàn)表1。

1.1.2 溫室栽培 于2014年9月20日在貴州省牧草種子檢測(cè)中心溫室大棚內(nèi)播種。參照吳永潔等的方法[7]，從19份材料中各選取1個(gè)果實(shí)飽滿的花序，將來(lái)自同一花序的種子播入有32個(gè)小格的育苗盤中，每小格播2粒種子，3個(gè)月成苗期后，在形態(tài)多樣性研究的基礎(chǔ)上，選擇形態(tài)上有代表性的幼苗進(jìn)行SSR標(biāo)記試驗(yàn)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 DNA提取試劑盒（購(gòu)自大連寶生物公司）;26對(duì)SSR引物（由大連寶生物公司合成）。

1.2 白三葉總DNA提取

取野生白三葉新生葉片，提取總DNA。用0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

1.3 SSR-PCR擴(kuò)增體系與程序

參考牟彤等的白三葉SSR分析體系[12-13]，通過(guò)單因素梯度組合試驗(yàn)，得到優(yōu)化后最優(yōu)的白三葉20 μL反應(yīng)體系：模板20 ng，10×PCR Bufer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）2.4 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL） 0.1 μL，上、下游引物均為0.6 μL（0.1 mmol/μL），用滅菌水補(bǔ)足20 μL，覆蓋礦物油。

1.4 引物篩選

參照Z(yǔ)ietkiewicz等的研究[14-15]，挑選出多樣性較高的26對(duì)SSR引物，并將其交由大連寶生物公司合成。從供試材料中選出質(zhì)量較高且形態(tài)性狀差異較大的W11及W12材料對(duì)26對(duì)引物進(jìn)行剔選，最終選出20對(duì)多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、條帶清晰的引物對(duì)全部材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表2。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)凝膠電泳后獲得清晰穩(wěn)定的DNA擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上的譜帶，有帶的賦值為“1”，無(wú)帶的賦值為“0”，建立遺傳相似矩陣。通過(guò)該矩陣，統(tǒng)計(jì)SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總條帶數(shù)和具有多態(tài)性的條帶數(shù)，用Excel計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率PPB（PPB=NPB/TNB×100%，其中TNB指 SSR-PCR 擴(kuò)增的總條帶數(shù)，NPB指具有多態(tài)性的條帶數(shù)[16]）、標(biāo)記指數(shù)MI（MI=NPB×PIC）[17]、引物多態(tài)性信息含量PIC[PIC=2fi（1-fi），其中fi表示有帶的所占的頻率]。用NTSYS-PC 2.02軟件計(jì)算Dice遺傳距離GD[GD=1-2Nij/（Ni+Nj），其中Ni指材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)，Nj指材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)，Nij指材料i和j共有的擴(kuò)增片段數(shù)]，用以估計(jì)各白三葉種質(zhì)間的遺傳多樣性[16，18]。根據(jù)非加權(quán)組平均法（UPGMA）法進(jìn)行遺傳相似性聚類分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州野生白三葉同一花序DNA純度檢測(cè)

采用0.75%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的19份野生白三葉DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1（圖中1～19對(duì)應(yīng)19份材料），可見(jiàn)DNA的完整性較好，純度較高。