ISTR標記在榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應用

俞飛飛 周軍永 陸麗娟

摘要：利用反向序列標簽重復技術（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）對43份安徽省榧樹種質(zhì)資源及3份浙江省榧樹資源進行了遺傳多樣性分析。ISTR能很好地用于榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，多態(tài)性比例為87.09%，46份榧樹種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為0.548 4～1.000 0，表明安徽省榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。采用UPGMA（非加權(quán)組平均算法）對46份種質(zhì)的ISTR數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果顯示可分為3個類群，來自同一地方的種質(zhì)基本上都獨立聚成類群，表明種質(zhì)間親緣關系與地理來源關系較為密切;相似的種質(zhì)類型聚為一類，可能與實生繁殖方式有關。ISTR標記可在榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中被廣泛地應用。

關鍵詞：香榧;反向序列標簽重復技術;遺傳多樣性

中圖分類號： S791.530.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0038-03

榧樹（Torreya grandis）屬裸子植物紅豆杉科（Taxaceae）榧屬（Torreya）常綠喬木，為第3紀孑遺植物，是我國特有的珍稀樹種。安徽省榧樹種質(zhì)資源豐富，多呈野生或半野生狀態(tài)，主要分布于黃山市的黟縣、休寧縣、歙縣、徽州區(qū)和黃山區(qū)，宣城市的寧國市、宣州區(qū)和績溪縣，池州市的石臺縣有少量分布，此外，大別山區(qū)的霍邱、舒城等地也有零星分布[1-6]。

反向序列標簽重復技術（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）是逆轉(zhuǎn)座子的分子標記，較常規(guī)分子標記靈敏[7]，使用的是通用引物，免去了前期逆轉(zhuǎn)座子特異引物開發(fā)步驟，降低了試驗成本和提高了效率。目前已在椰子[8]、葡萄[9]、柑橘[10]和柿[11]等果樹樹種的指紋分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)進化分析和種質(zhì)鑒定等研究中得到應用。

隨著香榧經(jīng)濟價值的不斷提高，榧樹的種質(zhì)資源開發(fā)和利用受到重視，特別注重優(yōu)良品質(zhì)的榧樹資源利用，同時受到來自諸暨香榧等細榧品種的影響，安徽省很多野生和半野生的榧樹被改接，從而造成榧樹種質(zhì)資源的流失，并且前人對安徽省榧樹資源遺傳多樣性的研究很少。本試驗擬探討ISTR標記在榧樹種質(zhì)鑒定和親緣關系分析中應用的可行性，以期為今后開展遺傳多樣性評價、雌雄性別鑒定、種質(zhì)鑒定和親緣關系分析等研究提供新的研究手段，對榧樹資源的保存利用具有重要的研究意義。

1 材料與方法

本研究中所采用的榧樹種質(zhì)資源共46份（表1），于2017年6月采自安徽省榧樹主產(chǎn)區(qū)的寧國市、黟縣、宣城等地;其中諸暨香榧引自浙江省諸暨市。試驗于2017年8月在園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制及生理生態(tài)安徽省重點實驗室進行。

采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）提取榧樹葉片DNA，DNA終濃度稀釋至10 ng/μL備用。ISTR擴增及其產(chǎn)物檢測參考Rohde的方法并作優(yōu)化[8]。引物序列參考Aga等的報道[12]（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系（20 μL）：模板DNA（2 μL），Buffer 1×（5 μL），Mg2+ 2.5×10-3 mol/L（5 μL），dNTP 2.5×10-3 mol/L（5 μL），Taq酶1 U（1 μL），引物1.0×10-6 mol/L（2 μL）。擴增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次;72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄譜帶。

PCR擴增試驗重復2次，不能重復的條帶統(tǒng)計時忽略不計。強帶、弱帶均記為1，同一位置無帶記為0，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。用NTSYS-pc 2.10軟件進行相似系數(shù)計算和基于非加權(quán)組平均算法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的聚類分析，構(gòu)建樹狀圖，分析榧樹種質(zhì)資源親緣關系。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISTR多態(tài)性分析

共篩選12對引物，其中4對引物的擴增譜帶清晰且重復性好。由表3可見，4對引物的擴增總帶數(shù)為31條，27條（占87.10%）具多態(tài)性;擴增片段長度為100～5 000 bp;單引物對多態(tài)位點比例為77.78%～100%;不同引物組合的種質(zhì)鑒定能力差異較大，4對引物組合可以將46份種質(zhì)資源按來源地區(qū)分，證明ISTR可用于榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。

2.2 品種及雌雄性鑒別

由4條引物擴增出的27個多態(tài)性位點，大多數(shù)譜帶在供試材料間不具有獨特性，來自寧國市方塘鄉(xiāng)的種質(zhì)資源和諸暨香榧多態(tài)性豐富，能與其他種質(zhì)資源明顯區(qū)分。圖1結(jié)果顯示， 17號樣本為雄性榧樹，在500 bp左右出現(xiàn)獨特性擴增位點，與雌性榧樹有明顯區(qū)分，作為雌雄性鑒定的依據(jù)有待于進一步研究。

2.3 基于ISTR的相似指數(shù)及親緣關系分析

46份榧樹種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為0.548 4～1.000 0，表明安徽榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富，其中來自黟縣的圓榧類種質(zhì)的相似系數(shù)最大，為1.000 0，表明圓榧類的親緣關系最近。

采用UPGMA法，根據(jù)相似系數(shù)對46份榧樹種質(zhì)進行聚類分析（圖2），在相似系數(shù)為0.82時，46份種質(zhì)可分為3個類群。第1類群包含2份種質(zhì)，來自寧國市方塘鄉(xiāng)。

第2類群包含7份種質(zhì)，以相似系數(shù)0.87為界，可分為2個亞類，第1亞類包含4份種質(zhì)，其中寧國市方塘鄉(xiāng)3份，寧國市青龍鄉(xiāng)1份;第2亞類含有3份種質(zhì)，其中2份來自浙江省（諸暨香榧），1份來自安徽省寧國市方塘鄉(xiāng)。

第3類群含有37份種質(zhì)，以相似系數(shù)0.91為界，分為4個亞類。第1亞類包含30份種質(zhì)，第2亞類僅含有1份種質(zhì)（來自宣城市水東鎮(zhèn)），第3亞類包含5份種質(zhì)，全部來自寧國市青龍鄉(xiāng)，第4亞類包含1份種質(zhì)（來自寧國市青龍鄉(xiāng)）。在相似系數(shù)0.94處，第1亞類可分為5小類，第1小類包含8份種質(zhì)，其中2份種質(zhì)來自寧國市，1份種質(zhì)來自宣城市，5份種質(zhì)來自黟縣（5份種質(zhì)聚為一類，且圓榧類種質(zhì)親緣關系近，聚為一類）;第2小類包含4份種質(zhì)，3份來自宣城市，1份來自寧國市;第3小類包含17份種質(zhì)，8份來自宣城市，1份來自浙江省（諸暨香榧），8份來自黟縣，其中來自黟縣的多為圓榧類種質(zhì)，且聚為一類;第4小類僅包含1份種質(zhì)（來自宣城市溪口鎮(zhèn)）。

3 討論

本研究中所使用的ISTR分子標記是基于椰子Ty1-copia逆轉(zhuǎn)座子序列開發(fā)而來的[8，12]，試驗的目的在于探討ISTR分子標記在榧樹種質(zhì)資源中的適用性及其用于研究榧樹資源親緣關系的可行性。本試驗中ISTR多態(tài)性比例為8709%，多態(tài)性比例較高，且關于榧樹逆轉(zhuǎn)座子標記未見報道， 使用通用引物較以特異性引物開發(fā)為前提的逆轉(zhuǎn)座子標

記成本低，因此ISTR是較便捷的逆轉(zhuǎn)座子標記。

本試驗結(jié)果顯示，46份榧樹種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為 0.548 4～1.000 0，榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。聚類分析結(jié)果顯示第1類群全部來自寧國市方塘鄉(xiāng);第2類群包含7份種質(zhì)，其中5份來自寧國市，2份來自浙江省（諸暨香榧）;46份種質(zhì)中的37份屬于第3類群，基本包含了所有的采樣地區(qū)，其中第1亞類包含30份種質(zhì)，第2亞類僅含有1份種質(zhì)（來自宣城市水東鎮(zhèn)），第3亞類包含5份種質(zhì)，全部來自寧國市青龍鄉(xiāng)，第4亞類包含1份種質(zhì)（來自寧國市青龍鄉(xiāng)）。第1亞類又分為5小類，第1小類包含8份種質(zhì)，其中2份種質(zhì)來自寧國市，1份種質(zhì)來自宣城市，5份種質(zhì)來自的黟縣;第2小類包含4份種質(zhì)，3份來自宣城市，1份來自寧國市;第3小類包含17份種質(zhì)，8份來自宣城市，1份來自浙江省（諸暨香榧），8份來自黟縣，其中來自黟縣的多為圓榧類種質(zhì)，且聚為一類;第4小類僅包含1份種質(zhì)（來自宣城市溪口鎮(zhèn)）。由于安徽省榧樹資源分布呈現(xiàn)地域性，在相對獨立的環(huán)境中進化;同一地理來源的種質(zhì)間基因交流頻繁，從而使親緣關系較近，遺傳變異系數(shù)相對較低;遺傳距離與地理距離具有一定的相關性，安徽省榧樹資源中來自同一區(qū)域的多聚為小類，但聚為一類的榧樹種質(zhì)并非都來自同一地區(qū)，這可能與地區(qū)之間的引種有關，也可能與本試驗所選用的ISTR引物數(shù)量有限相關。此外，遺傳多樣性水平受繁育方式影響[13]，來自黟縣的種質(zhì)資源多為圓榧類，親緣關系非常近，聚在一起，這可能與長期的實生播種繁殖方式有關。

本研究中所選的引物擴增出的多態(tài)性位點在供試材料間具有獨特性，來自寧國市方塘鄉(xiāng)的榧樹種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。利用F8/B6引物組合進行擴增時，17號樣本（雄株）在500 bp左右出現(xiàn)獨特性擴增位點，與雌性榧樹有明顯區(qū)分，其特異性位點擴增作為雌雄性鑒定的依據(jù)有待于進一步研究。

本研究中ISTR產(chǎn)物使用高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測手段獲得較好的結(jié)果，表明高濃度瓊脂糖凝膠電泳可用于檢測ISTR產(chǎn)物，提高了試驗效率[11]。試驗中發(fā)現(xiàn)用高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測部分引物擴增結(jié)果時，條帶有密集現(xiàn)象;目前報道多采用的聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）檢測方式具有分辨率高等優(yōu)點。因此，今后應依據(jù)試驗目的、遺傳背景等方面選擇ISTR產(chǎn)物檢測方式。

安徽省榧樹種質(zhì)資源豐富，其中不乏新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良株系[1]，但野生榧樹的低收益，使得農(nóng)戶疏于管理或改接為諸暨香榧，從而造成榧樹種質(zhì)資源的逐年減少，分析安徽省榧樹種質(zhì)的遺傳多樣性有助于了解其親緣關系和從中篩選優(yōu)良株系。本試驗探討ISTR標記在榧樹種質(zhì)鑒定和親緣關系分析中應用的可行性，以期為今后開展遺傳多樣性評價、雌雄性別鑒定、種質(zhì)鑒定和親緣關系分析等研究提供新的研究手段，對榧樹資源的保存利用具有重要的研究意義。

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