水性涂料中微生物群落結構及其多樣性分析

馬永凱, 陶宏兵,2, 李文茹, 謝小保*, 施慶珊, 周少璐

1.廣東省微生物研究所, 華南應用微生物國家重點實驗室; 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室, 廣州 510070;2.廣東迪美生物技術有限公司，廣州510663

水性涂料是一種較為常見的新型涂料，一般用水作溶劑或分散介質，因其來源廣、成本低、無毒無刺激及易清洗等優點而被廣泛應用于裝飾、船舶、汽車等行業。然而與其他涂料相比，水性涂料中的水介質以及纖維素、環氧樹脂等高分子材料也使得其更易受到環境中微生物的污染，導致產品變質，出現變色、異味、粘度下降等現象，這不僅給經銷商增加了退換貨的物流、人力成本，也給生產商造成了不可挽回的經濟損失[1～3]。現階段，為了防控水性涂料產品受微生物的侵害，大部分廠家采取的措施為提高防腐劑使用量，但是，由于原材料來源、操作工藝和生產環境的不同，不同廠家的水性涂料產品發生微生物污染的種類有較大差別[4,5]。不同種類的微生物代謝產物導致產品腐敗變質的性質與傳統防腐劑的有效性息息相關。因此，對變質的水性涂料中的微生物群落進行檢測和全面分析是很有必要的，同時這對建立水性涂料的微生物防控體系也具有重要的指導意義。

通過傳統的微生物純培養對水性涂料進行微生物群落組成及多樣性分析，存在工作量較大、周期較長、分離所得微生物重要性被過高估計以及可能遺漏潛在的重要有害污染微生物等缺點。而且，自然界中有一部分微生物種群難以被分離純培養，導致傳統的微生物純培養方法在樣品群落結構及多樣性分析應用方面存在較大局限性[6～8]。近年來，隨著高通量測序技術的飛速發展，測序成本不斷降低，利用Illumina公司開發的16S rRNA高通量測序技術可以快速、準確地獲得樣本中微生物群落組成的結構信息，通過生物信息學分析還可進一步挖掘出樣品中微生物群落相互之間的進化規律，因此能更好的防控樣品受到環境中微生物的污染。此外，高通量測序技術還可以檢測到傳統的微生物純培養方法在實驗室條件下不能培養的細菌種群[9～12]，可見該技術在涂料樣品中微生物群落結構及多樣性分析方面具有廣闊的應用前景。基于此，本研究以水性涂料中微生物群落為研究對象，對其進行16S rRNA高通量測序，分析群落結構組成、相對豐度和多樣性，以期明晰水性涂料中微生物群落結構組成情況，為建立水性涂料有效防腐體系提供數據與理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究所用的水性涂料樣品由廣東省某涂料公司提供，且這些樣品均有一定程度的脹罐、異味等腐敗變質現象，分別被命名為XJ1、XJ2、YH3和YH4，各設3個平行。

1.2 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖、TBE緩沖液及DNA Marker均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他生化試劑均為分析純，購于廣州化學試劑廠。NanoDrop超微量核酸定量儀(美國賽默飛世爾科技公司)；超純水儀(美國Millipore公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 DNA提取與測序

將4種水性涂料樣品分別溶解在滅菌的去離子水中作為各自的樣本，然后按照DNA提取試劑盒的操作說明提取總DNA，并用DNA純化試劑盒純化已提取的DNA樣本。隨后，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性，同時用超微量核酸定量儀檢測其濃度及OD260/OD280，體積為1 μL。將驗證過的DNA樣本于-80℃冷凍保存備用，然后利用廣州美格生物科技有限公司的Illumina MiSeq/HiSeq測序平臺對樣本中微生物16S rRNA基因的V3-V4區(336F-806R)進行測序分析[13,14]。

1.4 數據處理分析

為了保證OTU(operational taxonomic units)聚類及后續分析的準確性，需對Illumina測序得到的原始數據(raw reads)進行過濾處理，然后將處理后的數據進行拼接、過濾，得到有效序列(effective tags)。再基于有效數據進行OTU聚類和物種分類分析，形成OTU物種豐度譜和其他物種分類等級的物種豐度譜；同時，基于數據均一化后的OTU物種豐度譜，再對OTU進行豐度、多樣性指數等分析，如Alpha多樣性值、Beta多樣性值等，其中Alpha多樣性值包括物種(observed species)指數、Chao指數、香農(Shannon)指數、系統發育樹(PD whole tree)指數等。下一步，對注釋在各個分類水平上的物種進行群落結構統計分析和基于OTU和物種組成的聚類分析(如PCoA等統計分析)，從而挖掘樣品之間的微生物組成差異，尋找與環境顯著相關的物種群落[15,16]。

2 結果與分析

2.1 水性涂料樣本測序結果及取樣深度驗證

對水性涂料中微生物16S rRNA基因的V3-V4區(336F-806R)進行高通量測序的下機數據預處理統計結果如表1所示，結果表明4個樣本原始序列共174 392條，通過過濾嵌合體、篩選掉低質量的序列后，得到的有效序列(effective tags)為171 822條，平均測序讀長為375 nt。

表1 水性涂料樣本的序列信息Table 1 Sequence information of waterborne coatings samples.

為了研究4個涂料樣本的物種組成及多樣性信息，對所有樣本的全部有效序列在97%相似度下進行聚類，形成OTU。再將得到的OTU序列與核糖體RNA數據庫進行比對獲得物種注釋信息，同時基于物種注釋信息，去除注釋為葉綠體、線粒體以及不能注釋為界級別的OTU及其包含的序列后，不同樣本的序列、OTU數目統計結果及其在各分類水平上的序列構成結果如圖1A、B所示。從圖1A可知，4個樣本過濾后得到的拼接序列總數的平均值和最終得到的OTU總數的平均值分別為42 956、398。圖1B表明了不同樣本在各分類水平上的序列構成的復雜程度，可見樣品YH4和XJ2的物種復雜度低于XJ1和YH3。

與此同時，為了探究水性涂料樣本測序數據量的科學性和不同樣本反映的樣品中物種的豐富程度，從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，統計其所代表的物種多樣性指數，以數據量與物種多樣性來構建曲線，結果如圖1C所示，表明隨著數據量的增加，曲線已經趨于平緩，即再增加數據量對于物種的挖掘也沒有顯著影響，樣本的OTU覆蓋度已經基本飽和，這個結果說明測序結果的數據量漸進合理。

圖1 水性涂料樣本16S rRNA高通量測序數據分析Fig.1 Analysis of 16S rRNA high-throughput sequencing data of waterborne coatings samples.A：水性涂料樣本的序列、OTU數目分析；B：水性涂料樣本各分類水平上的序列構成；C：水性涂料樣本的稀釋曲線。

2.2 水性涂料樣本的物種分類樹分析

為了進一步探究水性涂料樣本中微生物群落組成多樣性及其系統進化關系，在已獲得的所有OTU序列中選取物種豐度最高的10個屬的OTU數據進行系統進化分析，進一步得到4個水性涂料樣本間的物種分類樹及物種相對豐度統計分析圖(圖2)。由圖2可知，在水性涂料樣本YH4、XJ1、XJ2和YH3的微生物群落中，優勢菌群均是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。此外，從圖2中可以看出，三大優勢菌群的分支較多，這說明優勢菌群在水性涂料樣本中的基因型呈現多樣性。

2.3 水性涂料樣本的微生物多樣性分析

2.3.1Alpha多樣性分析 為了對水性涂料樣本中的單一樣本進行物種多樣性分析，本研究對水性涂料樣本的物種(observed species)指數、香農指數、Chao1指數和譜系多樣性(phylogenetic diversity)指數等進行了統計分析，結果如表2所示。一般情況下，評估某個樣本的物種多樣性的指數越高，表明樣本的多樣性越復雜，反之則表明樣本的多樣性越簡單。

由表2可知，水性涂料樣本XJ1和YH3的物種多樣性的復雜程度高于樣本XJ2及YH4。其中，水性涂料樣本XJ1的物種指數(846.0)、香農指數(6.400 6)、Chao1指數(869.887 9)和譜系多樣性指數(61.561 2)在4個樣本中都是最高的，說明該樣本的微生物群落組成最復雜。其次，通過比較剩余3個水性涂料樣本的相關數據發現，樣本YH3的物種指數(477.0)、香農指數(5.007 2)、Chao1指數(523.928 6)和譜系多樣性指數(38.498 5)高于XJ2和YH4，說明樣本YH3的微生物群落結構的復雜程度高于XJ2和YH4。同時，通過比較表2中的水性涂料樣本XJ2和YH4可知，樣本XJ2的香農指數(0.968 0)高于樣本YH4(0.498 17)，說明水性涂料樣本XJ2的豐富度和每個分類中所占的比例高于樣本YH4，但樣本XJ2的Chao1指數(99.750 0)及譜系多樣性指數(8.935 8)均低于樣本YH4(分別為154.285 7和12.999 6)，表明樣本XJ2的物種多樣性低于YH4。綜上所述，經Alpha多樣性指數統計分析，可以得出4個水性涂料樣本的物種多樣性由高到低依次分別為XJ1、YH3、YH4和XJ2。

2.3.2Beta多樣性分析 Beta多樣性是對不同樣品間的微生物群落多樣性進行比較，可以通過多變量統計學方法主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)和非加權組平均聚類分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)，進一步從數據結果中挖掘不同樣品間微生物群落多樣性的差異和不同分類對水性涂料樣本間的貢獻差異。

以4個水性涂料樣本為研究對象，基于Bray-Curtis距離來進行主坐標分析，得到不同水性涂料樣本的Beta多樣性的PCoA分析結果(圖3A)。一般情況下，主坐標分析的二維圖中不同樣本的距離越近，說明樣本間的物種組成多樣性越相似，由圖3A可知，水性涂料樣本XJ2和YH4聚集在一起，表明這2個樣本之間的微生物群落多樣性較為相似。另一方面，圖3A顯示第一主成分的貢獻率(94.38%)遠大于第二主成分(5.19%)，說明第一主成分坐標相近的樣本在微生物群落多樣性方面也是較為相似的，可見水性涂料樣本XJ1與YH3也是較為相似的。

表2 水性涂料樣本的Alpha多樣性指數分析Table 2 Alpha diversity index analysis of waterborne coatings samples.

圖3 水性涂料樣本Beta多樣性主坐標分析(A)和聚類分析(B)Fig.3 Beta diversity analysis PCoA (A) and UPGMA (B) of waterborne coatings samples.

進一步地，通過對不同樣本進行聚類分析研究這4個水性涂料樣本的微生物群落多樣性。不同水性涂料樣本的Beta多樣性的聚類分析UPGMA結果如圖3B所示，結果表明水性涂料樣本XJ2和YH4微生物群落多樣性較為相似，同理，樣本XJ1和YH3的微生物群落組成也是較為相似的。然而，水性涂料樣本XJ2、YH4和樣本XJ1、YH3的微生物群落多樣性也存在差異，這說明水性涂料發生腐敗變質是受到了不同微生物的污染。

2.4 水性涂料樣本的微生物組成分析

為了統計每個水性涂料樣本中微生物群落的組成及相對豐度，利用QIIME軟件對各水性涂料樣本在門分類水平上的物種相對分布情況進行統計分析，結果如圖4所示。由圖4可知，在門分類水平上，4個水性涂料樣本經統計分析后共得到16種細菌類群，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為三大優勢菌群，其中，在4個水性涂料樣本中含量最高的微生物群落均是變形菌門(Proteobacteria)，其在樣本YH4、XJ1、XJ2和YH3中的相對豐度分別為97.75%、62.53%、99.76%和75.80%，這說明誘發4個水性涂料樣本發生腐敗變質的微生物群落組成基本相同；同時，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在樣本YH4、XJ2中的相對豐度均不足3.00%，說明水性涂料樣本發生微生物污染還受到原材料來源、生產工藝或者環境因素的影響。

圖4 門分類水平上水性涂料樣本微生物相對豐度分析Fig.4 Relative abundance analysis at phylum level of waterborne coatings samples.

2.5 水性涂料樣本的菌群結構差異分析

為了進一步探究4個水性涂料樣本中微生物群落組成之間的聚集規律，從所有樣本在屬分類水平上的物種注釋及豐度信息中選取默認豐度排名較高的10個屬，并利用其在各水性涂料樣本中的豐度信息，構建含有水性涂料樣本聚類關系樹的熱圖(圖5)。由圖5可知，在屬分類水平上，微生物群落經過微生物豐度聚類分析后分為兩大分支，水性涂料樣本YH4和XJ2構成一支，而YH3和XJ1構成另一支，這說明它們之間的微生物群落組成存在明顯差異。此外，水性涂料樣本YH4和XJ2的微生物群落進化關系距離較近，樣本YH3居于樣本XJ1與XJ2之間且微生物群落進化關系距離更趨近于XJ1，說明相對于水性涂料樣本YH3和XJ1而言，水性涂料樣本YH4和XJ2微生物群落組成和聚集規律更相似。

圖5 屬分類水平上水性涂料樣本微生物豐度聚類分析Fig.5 Microbiology abundance cluster analysis at genus level of waterborne coatings samples.注：刻度尺表示顏色與相對豐度的關系。

3 討論

與傳統的微生物純培養方法相比，16S rRNA高通量測序技術是一種針對樣本中微生物群落較為全面的檢測方式，而且，在分析水性涂料中微生物群落組成和多樣性方面，16S rRNA高通量測序具有傳統的微生物純培養方法無可比擬的優勢，其可對水性涂料中所有微生物群落無選擇的檢測，且周期短、準確度高[17～19]。本研究利用16S rRNA高通量測序技術檢測了4個水性涂料樣本的微生物群落，獲得了樣品中全面的微生物群落結構、相對豐度及多樣性信息，共獲得有效序列總數171 822，且在97%的相似度水平下共產生有效OTU個數為1 592，平均測序讀長為375 nt，涵蓋了30門66綱98目174科340屬的細菌。

同時，利用生物信息學方法初步解析了水性涂料樣本中微生物群落結構、相對豐度及多樣性。結果表明，在水性涂料樣本XJ1、XJ2、YH3和YH4中，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為三大優勢菌群；Alpha多樣性指數統計分析顯示物種多樣性由高到低依次分別為XJ1、YH3、YH4和XJ2；水性涂料樣本的Beta多樣性分析、微生物菌群結構均顯示樣本YH4與XJ2聚集規律更相似，說明不同樣品間的微生物群落存在差異，出現這種現象的原因可能是水性涂料的原材料來源、生產配方、操作工藝、儲存溫度和濕度等因素的不同導致樣品間微生物群落的差異。

變形菌門在所有水性涂料樣本中的最高相對豐度達到99.76%，說明該菌群是水性涂料樣本產生微生物污染的最主要來源，該結果也與其他文獻報道結果一致：黃小茉等[2]利用基因文庫技術對水性涂料中細菌菌群分析發現，變形菌門下的假單胞菌為優勢菌群，且該菌群對于水性涂料發生腐敗變質具有重要影響；陳藝彩等[20]以涂料樣本為研究對象，采用傳統微生物純培養的方法分離出76株腐敗微生物并對其鑒定，發現大腸桿菌和銅綠假單胞菌在涂料腐敗變質方面是重要的菌株來源，而這2種菌也屬于變形菌門。此外，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門在4個水性涂料樣本中的相對豐度差異較大，由微生物組成分析結果可知水性涂料樣本XJ2和YH4中的厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度低于樣本XJ1和YH3，這說明在水性涂料樣本發生腐敗變質的過程中，樣本原材料來源、溫度、生產工藝或者貯存環境的不同也可能導致某些微生物快速繁殖并進一步加速腐敗變質過程，出現這種現象的原因可能是由于水性涂料產品長期固定使用單一品種的防腐劑配方，雖然限制了厚壁菌門和擬桿菌門在水性涂料產品中的微生物生長，但同時促進了變形菌門或其他微生物群落的細菌生長繁殖。與此同時，水性涂料產品中微生物群落結構組成的明晰，有利于企業加強對水性涂料產品的原材料、生產工藝關鍵環節的消毒程序、儲存運輸環節的微生物控制，還可以根據變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門微生物群落的生長特性，優化升級水性涂料中的防腐劑配方，這對于今后的水性涂料微生物防控體系的建立和完善也有一定的指導意義。

利用16S RNA高通量測序技術對水性涂料的研究只是初始階段，獲得的微生物群落結構與多樣性數據較少[2,5,6]。目前，對于水性涂料出現腐敗變質現象的機理尚無明確結論，而這直接關系著水性涂料樣本的防腐體系是否有效，關系著生廠商的直接經濟利益，所以，獲取更多水性涂料樣本中微生物群落結構及多樣性信息對于行業發展迫在眉睫[4,19]。隨著越來越多的微生物菌群結構數據被獲取，對于水性涂料出現腐敗變質現象的機理就越容易被闡釋清楚，有利于各生廠商因地制宜、多元化建立自身的微生物防控體系。此外，由于16S rRNA高通量測序技術自身的限制，水性涂料樣本微生物群落結構中的真菌還不能夠被檢測到，仍需進一步地深入研究，而隨著測序技術的不斷發展，涂料樣本中微生物群落結構及多樣性會日漸明晰，將為建立高效的水性涂料防腐體系提供充分的微生物數據支持及理論支撐。