金針菇菌渣和醋渣固態發酵的工藝研究

費 凡, 馮偉偉, 茆廣華, 張偉杰, 丁陽陽, 趙 婷, 吳向陽*

1.江蘇大學環境與安全工程學院, 江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學食品與生物工程學院, 江蘇 鎮江 212013；3.江蘇大學化學化工學院, 江蘇 鎮江 212013

食用菌菌渣是指在食用菌生產的最后環節采收后所剩下的部分及剩余的培養基，因其營養成分大部分已被吸收，也被稱為培養基殘料或菌糠。中國是食用菌生產和食用大國，食用菌的總產量從2000年的608萬t穩步增長到2016年的3 596余萬t，占世界總產量的70%以上[1]。伴隨著食用菌產業的發展，采收食用菌子實體后的栽培廢棄物——菌渣的產生量越來越多[2]。據統計，荷蘭菌渣的產生量每年達2.1×106m3，美國菌渣的產生量每年達3.4×106m3[3]，而我國作為食用菌生產量最大的國家，每年至少會產生約5 214萬t的菌渣[4]。目前，食用菌菌渣處理方法主要是丟棄或焚燒，不僅造成了資源的浪費，且對環境造成了污染[5]。醋渣是制醋產業的主要副產物之一，其主要成分是稻殼、麩皮等，具有一定的酸性和腐蝕性，會對環境產生不利影響。我國的制醋產業發達，每年至少會產生超過300萬t的醋渣[6]。現階段對醋渣的主要處理方式是填埋和焚燒，不僅浪費資源，也對環境造成二次污染[7]。因此亟需探索新的金針菇菌渣和醋渣的資源化利用方式，減少環境污染的同時對其進行二次利用。

研究發現，金針菇菌渣的結構具有疏松多孔的特性，并含有豐富的纖維素、木質素、維生素、抗生素、礦質元素、蛋白質和多糖等生物活性物質，可用于制備食用菌的二次栽培基質、燃料、肥料和多糖等[8～10]。醋渣為制醋過程中的副產物，含有水分、粗蛋白質、粗纖維及豐富的微量元素等營養物質[11]，可用于制備燃料、飼料添加劑、食用菌栽培基質及酶制劑[12～14]。然而，若將金針菇菌渣和醋渣用作食用菌二次栽培基質等，也并未達到其資源化處理的終點，還是會產生食用菌菌渣和醋渣，且隨著再利用次數的增多，養分消耗殆盡，依然面臨廢棄物的處理問題；將其燃燒提供熱能的處理方式，也會產生二次污染物；此外，利用金針菇菌渣和醋渣堆肥制備肥料，也存在耗時長、發酵不充分及過程繁瑣等不足。

而發酵工藝的發展，尤其是固態發酵，為金針菇菌渣和醋渣的利用提供了新的途徑。固態發酵工藝是指培養基質呈固態且氣、液、固三相并存，并用一種或多種微生物發酵的一個生物反應過程，可用于快速、溫和的發酵農業固態廢棄物，實現其資源化利用。菌種是發酵過程中必不可少的物質，對發酵產品的質量、蛋白質轉化效率、發酵參數的控制等都起到決定性作用。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)等微生物對環境適應性強且能夠充分分解發酵原料中的粗纖維和大分子蛋白等物質，同時，其代謝產物無毒、無副作用、性能穩定、不易變異且相互之間無拮抗作用，常用于固態發酵[15]。目前，已有關于工農業廢棄物資源化處理的相關研究，但采用固態發酵法對金針菇菌渣和醋渣進行發酵并摸索其固態發酵工藝的研究還未見文獻報道，有待探討。

基于此，本研究主要針對農業廢棄物——金針菇菌渣和醋渣的資源化利用率低、高附加值的開發利用少、環境污染嚴重等問題，尋求對其資源化高效利用的新途徑。蛋白質是構成細胞、血液、骨骼、肌肉、抗體、激素、酶、乳、毛及各種器官組織的主要成分，是生命活動所必需的養分，而充足的粗蛋白質可以為生物的生命活動提供必需的能量[16]。因此，本研究以粗蛋白質含量為考察指標，采用固態發酵法對金針菇菌渣和醋渣進行發酵，并優化其固態發酵工藝，以期提高其發酵產物中的粗蛋白質含量，為農業廢棄物的資源化高效利用提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金針菇菌渣和醋渣，由江蘇步龍生物科技有限公司提供。枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母菌保存于中國工業微生物菌種保藏管理中心；硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸和亞甲基藍指示劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1810-B型石英自動雙重純水蒸餾器(江蘇金壇華晶石英玻璃廠)，BS124S型分析天平(賽多利斯儀器(北京)有限公司)，101型電熱鼓風干燥箱(鞏義市英峪予華儀器廠)，元素分析儀(珀金埃爾默儀器(上海)有限公司)，ICP等離子體光譜儀(廣東天瑞儀器有限公司)。

1.3 金針菇菌渣與醋渣的基本組分分析

利用粉碎機將金針菇菌渣和醋渣粉碎，過40目篩，測定其灰分、粗脂肪、粗纖維、粗蛋白質和4種元素(C、N、H、P)的含量。

采用GB 5009.4-2016測定樣品中灰分的含量[17]；采用GB 5009.6-2016測定樣品中粗脂肪的含量[18]；采用GB/T 5009.10-2003測定樣品中粗纖維的含量[19]；采用GB 5009.5-2016測定樣品中粗蛋白質的含量[20]。

利用元素分析儀和電感耦合等離子質譜儀測定C、N、H和P的含量，具體操作為：準確稱取樣品0.2 g，加入硝酸和高氯酸(體積比4∶1)，硝化，再用0.05%鹽酸定容，利用電感耦合等離子質譜儀進行P含量的測定，同時利用元素分析儀測定上述樣品中C、N、H的含量[21]。

1.4 固態發酵工藝優化

1.4.1單菌發酵實驗 在發酵原料(金針菇菌渣和醋渣1∶1)100 g、發酵溫度25℃、接種量5%(菌液體積與固體發酵原料質量比(V/m)；即5 mL菌液與100 g發酵原料混勻)的條件下進行發酵，發酵時間為5 d，于每天的固定時間取樣。考察枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，以確定單菌發酵所需的最優菌種。采用GB5009.5-2016法測定粗蛋白質含量[20]。

1.4.2多菌發酵實驗 在發酵原料(金針菇菌渣和醋渣1∶1)100 g、發酵溫度25℃、接種量5%的條件下進行發酵，發酵時間為5 d，于每天的固定時間取樣。考察4組混合菌種(各菌種等比例混合)對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，具體組合為：枯草芽孢桿菌和黃孢原毛平革菌(枯+黃)、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母(枯+熱)、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母(黃+熱)以及枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母(枯+黃+熱)。

隨后，以等比例多菌發酵實驗中粗蛋白質含量達到峰值的天數為發酵時間，在發酵原料(金針菇菌渣和醋渣1∶1)100 g、發酵溫度為25℃、接種量5%的條件下進行發酵，考察4組混合菌種對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，具體組合為：枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母(混合菌液2∶1∶1)，枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母(混合菌液1∶2∶1)，枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母(混合菌液1∶1∶2)以及枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母(混合菌液1∶1∶1)。從而確定多菌發酵所需的最優菌種組合及比例。

1.4.3金針菇菌渣和醋渣配比優化 在發酵時間3 d、發酵溫度25℃、接種量5%的條件下，采用最優的菌種組合及比例進行多菌發酵，考察不同比例的金針菇菌渣和醋渣(10∶0、7∶3、1∶1、3∶7和0∶10)發酵原料(100 g)對發酵產物中粗蛋白質含量的影響。

1.4.4單因素實驗 影響發酵產物中粗蛋白質含量的主要因素有接種量、發酵溫度和pH等。采用單因素實驗對各因素進行考察，混合菌種接種量水平設置為：1%、3%、5%、7%和9%，發酵溫度水平設置為：20℃、23℃、26℃、29℃和32℃，pH水平設置為：6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。于發酵第3天取樣，考察各因素的不同水平對發酵產物中粗蛋白質含量的影響。

1.4.5正交實驗 在單因素實驗的基礎上，以pH、溫度(℃)和混合菌種接種量(%，V/m)為因素，以粗蛋白質含量為考察指標，采用L9(34)正交表進行發酵條件優化，各因素的實驗水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test.

獲得正交實驗的最佳條件后，在此條件下，進行驗證實驗，即在最優工藝條件下進行發酵，并測定其粗蛋白質含量。

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 金針菇菌渣和醋渣的基本組分分析

金針菇菌渣和醋渣的組分分析可探明其基本組分和營養物質，金針菇菌渣和醋渣的基本組分分析結果見表2。C和N是微生物發酵分解過程中所必需的元素，適當的C/N，可有助于微生物的發酵分解。研究表明，發酵基質的C/N為11～24時，發酵菌種較為活躍，發酵效率達到最高[22]。如表2所示，金針菇菌渣中C和N含量分別為24.40%和2.16%，C/N為11.30；醋渣中的C和N含量分別為43.67%和1.88%，C/N為23.23。H則是發酵過程中生成水的主要來源，是固態發酵中不可或缺的一種元素，金針菇菌渣和醋渣中H元素的含量分別為3.21%和5.87%。P元素是主要的營養元素，在發酵過程中起著能量調節的作用，金針菇菌渣和醋渣中的P含量分別為3.20%和6.36%。由此可見，金針菇菌渣和醋渣具有豐富的營養物質和能量物質，二者經混合后可用于固態發酵。

表2 金針菇菌渣及醋渣的主要成分Table 2 Main components of F. velutipes residue and vinegar residue.

2.2 單菌發酵對發酵產物中粗蛋白質含量的影響

在金針菇菌渣∶醋渣為1∶1、發酵時間5 d、接種量5%、pH 7.0、發酵溫度25℃的條件下，考察不同菌種單菌發酵對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，結果如圖1所示。結果表明，3種菌種發酵過程中粗蛋白質含量整體呈先上升后下降的趨勢，且均在發酵后的第3～4天達到峰值。經枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母單菌發酵3 d后的粗蛋白質含量分別為13.9%、14.9%和14.1%。因此，若進行單菌發酵，可選擇黃孢原毛平革菌為發酵菌，發酵時間為3 d。

圖1 單菌發酵對發酵產物中蛋白含量的影響Fig.1 Effect of single bacteria fermentation on crude protein content of fermentation products.

2.3 多菌發酵對發酵產物中粗蛋白質含量的影響

在金針菇菌渣∶醋渣為1∶1、發酵時間5 d、接種量5%、pH 7.0、發酵溫度25℃的條件下，考察等比例混合菌種對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，結果如圖2所示。結果表明，多菌發酵過程中粗蛋白質含量的變化均呈先上升后下降的趨勢，且在發酵后的第3天達到峰值，其中以枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌及熱帶假絲酵母3個菌種1∶1∶1的混合菌液發酵產物中粗蛋白質含量最高，為18.5%，明顯高于單菌發酵和其他多菌發酵組。推測主要是由于菌種之間存在相互協作，增加了對原料的適應能力，所以發酵效果優于單菌發酵。因此，本研究采用多菌發酵，其組成及比例為：枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母1∶1∶1，發酵時間為3 d。

隨后，在金針菇菌渣∶醋渣為1∶1、發酵時間3 d、接種量5%、pH 7.0、發酵溫度25℃的條件下，進一步考察不同比例混合菌種對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，結果如圖3所示。其中，混合菌種枯草芽孢桿菌:黃孢原毛平革菌:熱帶假絲酵母為1∶1∶1時，發酵產物粗蛋白質含量最高，為18.0%。推測主要是由于發酵菌種在比例為1∶1∶1時協同作用最好，發酵效率高，從而發酵產物中的粗蛋白質含量較高。再次驗證本研究適合采用多菌發酵的方式，且組成及比例為枯草芽孢桿菌∶黃孢原毛平革菌∶熱帶假絲酵母為1∶1∶1。

圖2 多菌發酵對發酵產物中粗蛋白質含量的影響Fig.2 Effect of multi-bacteria fermentation on crude protein content of fermentation products.

圖3 不同比例混合菌種對發酵產物中粗蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of different ratio of multi-bacteria on crude protein content of fermentation products.

2.4 發酵原料配比對發酵產物中粗蛋白質含量的影響

在發酵時間3 d、混合菌種接種量5%、pH 7.0、發酵溫度25℃的條件下，考察發酵原料不同比例對發酵產物中粗蛋白質含量的影響，結果如圖4所示。結果表明，隨著發酵原料中金針菇菌渣含量逐漸減少、醋渣含量逐漸增加，發酵產物中粗蛋白質含量呈先上升后下降的趨勢，且在金針菇菌渣與醋渣的比例為7:3時達到峰值，此時的粗蛋白質含量為16.7%。其可能的原因是金針菇菌渣中的營養成分較高，更有利于混合菌種的代謝活動，因此金針菇菌渣所占比重越大，發酵產物粗蛋白質含量越高。但是在發酵原料全部為菌渣的發酵過程中，發酵物過于黏稠，不利于氧氣和營養物質的傳遞，從而導致發酵產物中粗蛋白質含量降低。因此，發酵原料最佳比例為金針菇菌渣:醋渣為7∶3。

圖4 發酵原料配比對發酵產物中粗蛋白質含量的影響Fig.4 Effect of material ratio on crude protein content of fermentation products.

2.5 單因素實驗結果

2.5.1混合菌種接種量對發酵產物中粗蛋白質含量的影響 接種量是固態發酵中極為重要的因素，接種量過少會導致發酵效果不佳，過多則會造成一定的浪費，甚至影響發酵效果。在金針菇菌渣:醋渣7:3、發酵時間3 d、pH 7.0、發酵溫度25℃的條件下，研究不同接種量對發酵產物中粗蛋白質含量的影響。從圖5可以看出，隨著接種量的增加，發酵基質中粗蛋白質含量呈先升高再下降的趨勢。這可能是由于接種量過低會導致發酵周期過長，在固定的時間內發酵不完全，從而導致粗蛋白質含量較低；而接種量過高則會導致混合菌種在極短的時間繁殖過于旺盛，相互擠壓生存空間、爭奪養分，從而導致發酵效率低，發酵產物的粗蛋白質含量較低。由圖5可知，發酵產物中的粗蛋白質含量在接種量為7%時最高，為16.6%。由此確定多菌發酵的最佳接種量為7%。

2.5.2發酵溫度對發酵產物中粗蛋白質含量的影響 在金針菇菌渣∶醋渣為7∶3、發酵時間3 d、混合菌種接種量7%、pH 7.0的條件下，研究不同發酵溫度對發酵產物中粗蛋白質含量的影響。從圖6可以看出，隨著發酵溫度的升高，發酵基質中的粗蛋白質含量呈先上升后下降的趨勢。這可能是由于混合菌種在溫度適中的環境下能夠正常發育繁殖，促進發酵的進行；若溫度過低，菌種活性降低甚至進入休眠，從而導致發酵緩慢，發酵產物中的粗蛋白質含量較低；若溫度過高，同樣影響菌種活性。由圖6可知，發酵產物粗蛋白質含量在發酵溫度為26℃時最高，為17.0%。因此，多菌發酵的最佳發酵溫度為26℃。

圖5 混合菌種接種量對發酵產物中粗蛋白質含量的影響Fig.5 Effect of inoculation amount of multi-bacteria on crude protein content of fermentation products.

圖6 發酵溫度對發酵產物中粗蛋白質含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on crude protein content of fermentation products.

2.5.3pH對發酵產物中的粗蛋白質含量的影響

在金針菇菌渣∶醋渣為7∶3、發酵時間3 d、混合菌種接種量7%、發酵溫度26℃的條件下，研究不同pH對發酵產物中粗蛋白質含量的影響。從圖7可以看出，發酵基質中的粗蛋白質含量隨著pH的升高呈逐漸升高的趨勢，并且在pH 7.0～7.5時趨于平緩，pH 7.5～8.0時又略微下降，可能是由于混合菌種在pH接近弱堿性的情況下能夠快速生長繁殖從而提高發酵的效率，增加發酵產物中的粗蛋白質含量，若pH過高則會影響混合菌種的正常代謝活動，從而降低發酵產物中的粗蛋白質含量。由圖7可知，pH 7.5時發酵產物中粗蛋白質含量最高，為16.8%。因此，多菌發酵的最佳發酵pH為7.5。

圖7 pH對發酵產物中粗蛋白質含量的影響Fig.7 Effect of pH on crude protein content of fermentation products.

2.6 正交實驗結果

在單因素實驗的基礎上，以pH、溫度、接種量為因素，選用L9(34)正交表進行發酵條件優化，結果如表3所示。由極差R可知，各因素對發酵產物中的粗蛋白質含量的影響大小分別為：發酵溫度>接種量>pH，即發酵溫度對發酵產物粗蛋白質含量的影響最大，接種量次之，pH最小。

由正交實驗方差分析表(表4)可知，溫度和接種量對發酵產物粗蛋白質含量的影響顯著，pH對發酵產物中的蛋白質含量的影響不顯著。

通過正交實驗篩選出的最佳結果的優化方案為A2B2C2，即pH 7.5，發酵溫度26℃，接種量7%。隨后，采用pH 7.5、發酵溫度26℃、接種量7%作為發酵條件進行發酵驗證實驗，發酵產物中粗蛋白質含量為17.90%，高于上述正交實驗的最大值。因此，pH 7.5、溫度26℃、接種量7%為本研究最優的固態發酵工藝條件。

表3 正交實驗結果表Table 3 Results of optimization test.

3 討論

單菌發酵和多菌發酵的實驗結果說明金針菇菌渣和醋渣固態發酵的最佳發酵方式為多菌發酵，且混合菌種的組成及比例為枯草芽孢桿菌、黃孢原毛平革菌和熱帶假絲酵母1∶1∶1。金針菇菌渣和醋渣的最佳配比為7:3，發酵時間為3 d。單因素實驗和正交實驗的結果表明，金針菇菌渣和醋渣固態發酵的最佳條件為發酵溫度26℃、接種量7%、pH 7.5，在該條件下，發酵產物中的粗蛋白質含量為17.90%。

柯斌榕等[23]以菌渣堆肥pH、電導率、含氮量和雙孢菇產量為參考指標，采用單因素實驗研究金針菇菌渣堆肥的發酵特性，結果表明，其堆肥時間為13 d，且隨著堆肥時間的延長，菌渣pH及含氮量呈上升趨勢，且金針菇菌渣堆肥的電導率較高。由此可見，金針菇菌渣堆肥存在發酵時間長、發酵產物pH過高和發酵過程溫度過高等不足。而本研究以金針菇菌渣和醋渣為原料進行固態發酵，經過工藝優化后能在較短的時間內完成發酵，且發酵過程中溫度和pH穩定。

表4 正交實驗結果方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal test results.

注：P<0.05表示差異具有顯著性。

研究表明，使用2%的金針菇菌渣替換飼糧中的玉米和豆粕，黃羽雞肉品質及雞肉中的粗蛋白質和總氨基酸顯著高于對照組，肉雞的日增重和采食量較對照組無顯著差異，可見，飼糧中添加金針菇菌渣對黃羽肉雞的生長性能及產量無影響，但可以改善雞肉的品質和營養價值[24]。陳永霞等[25]將醋渣加入飼料中飼養豬，以普通豬飼料為對照，結果表明，添加量為20%的醋渣可顯著增加20 kg和40 kg以上的仔豬的日增重量，還可抑制20 kg以上的仔豬的腹瀉率，可見，醋渣可作為飼料添加于生豬飼料中。說明金針菇菌渣和醋渣有利于畜禽的生長發育，可用作動物飼料。但直接向飼料中添加金針菇菌渣和醋渣存在飼料中粗纖維含量過高、粗蛋白質含量較低等問題，從而影響飼養動物的生長性能及其經濟效益[26]，本研究則通過優化金針菇菌渣和醋渣的固態發酵工藝，提高了其發酵產物的粗蛋白質含量，增加其營養價值。

本研究選擇金針菇菌渣和醋渣作為發酵原料，探究其最佳發酵工藝，提高發酵產物中的粗蛋白質含量，不僅能夠有效地解決金針菇菌渣和醋渣帶來的環境污染問題，還能對其進行資源化利用，是一種有效的固態廢棄物資源化利用的方法。但本研究僅對金針菇菌渣和醋渣固態發酵的工藝進行優化，未對優化后的發酵產物的利用做進一步研究；且由于金針菇菌渣和醋渣中粗纖維含量均較高，若將其加以實際應用，還需要通過固態發酵降低其粗纖維含量，以提高發酵產物的適口性。在后續的實驗中將對此繼續進行探究。