腺相關病毒的生產方式及其在基因治療中的應用

杜夢潭, 劉興健, 胡小元, 張志芳, 李軼女

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

近幾十年來人類對自身基因組進行了詳細探索，已經發現了數百個導致人類遺傳疾病的基因，新一代測序技術的發展極大的促進了這一進程，使得很多遺傳性疾病的相關基因得到了鑒定，傳統的手術和藥物并不能很好地治療這些疾病。因此，基因治療是一個正在飛速發展的學科，其通過病毒載體將正常基因導入到缺陷組織中，以替代或補償缺陷基因的功能，達到治療遺傳性或獲得性疾病的目的，其優勢在于有望通過一次性方式治療疾病，解決根本問題。因此，基因治療相關的病毒載體也受到廣泛關注，主要包括逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒以及非病毒載體，各有其優缺點[1]，其中，腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)載體因其低致命性、低免疫原性、宿主范圍廣泛且穩定表達等獨特優勢成為目前應用最為廣泛的基因治療載體。

腺相關病毒是一種無包膜包被的單鏈DNA缺陷型病毒，最早于1965年作為腺病毒制備物中的一種污染成分被發現[2]。目前應用于研究和臨床的是重組腺相關病毒載體(recombinant adeno-associated virus，rAAV)[3]。早在1996年，Flott等[4]將囊性纖維變性跨膜基因導入人的呼吸道并獲得表達且沒有任何不良反應，至此，以AAV為病毒載體的基因治療開始成為研究熱點。但生產AAV載體的制造過程極其復雜，成本非常昂貴且限制因素多，成為整個行業的瓶頸，因此，急需開發更高滴度、更加經濟的AAV載體制備技術，以滿足今后的臨床研究以及市場需求。本文就AAV的結構和功能、載體的生產方式以及目前在基因治療中的應用進行了綜述，以期為今后AAV載體大規模應用于市場提供參考。

1 腺相關病毒的結構和功能

AAV病毒顆粒無包膜，結構為直徑約20 nm的正二十四面體，其基因組為單鏈線性DNA，長約4.7 kb，包括兩個開放閱讀框和兩個末端反向重復序列(inverted terminal repeat, ITR)[5]。兩個開放閱讀框編碼4個Rep、3個Cap和1個APP蛋白(圖1),它們在AAV的潛伏期和感染期都起到了重要的作用。組成AAV的重要功能元件包括ITR序列、Rep、Cap蛋白和輔助病毒或者輔助病毒中的功能基因成分[7]。AAV的ITR由145個核苷酸組成，其中靠近末端的125個堿基是一個較長的回文結構，自身能夠通過堿基互補配對進行折疊，使得ITR呈現T字型的發卡結構[8]，是AAV復制、包裝、整合所需的唯一順式作用元件。rep基因由AAV p5啟動子和p19啟動子啟動表達，編碼4種非結構蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，如圖1所示，其中，Rep78/68蛋白負責將病毒基因組在潛伏期整合進宿主染色體中以及在感染期將其“拯救”，并在病毒顆粒包裝的過程中起著十分重要的作用，Rep52/40蛋白主要參與AAV基因組的組裝[9]。cap基因是由AAV基因組中的p40啟動子啟動，編碼結構蛋白VP1、VP2、VP3和APP蛋白，VP1和VP2對空的病毒外殼及完整病毒顆粒的裝配是必需的，APP蛋白促進AAV基因組進入病毒衣殼內，促進病毒顆粒的裝配與成熟[10]。

AAV作為一種復制缺陷型病毒，常用的輔助病毒包括腺病毒、巨細胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、猴皰疹病毒、牛痘病毒等，盡管不同的輔助病毒提供的基因并不相同，但都參與調節宿主細胞基因的表達，使AAV能夠在一個比較寬松的細胞環境中增殖。目前，為AAV提供輔助功能的基因已經確定，可以在無輔助病毒的條件下由一個質粒提供，由于不需要活的輔助病毒，其提供了一個更安全、更便利的替代逆轉錄病毒和腺病毒的基因傳遞系統[11]。

圖1 AAV的基因組結構[6]Fig.1 Genome structure of AAV[6]

迄今為止，已經找到來自人類的13種血清型，主要區別在于其衣殼蛋白Cap不同，對不同的組織和細胞有不同的感染效率[6]。AAV2是最早被發現和鑒定的血清型之一，在大多數的血清型中都有AAV2基因型的ITR序列；AAV1和AAV7主要靶向骨骼肌細胞；AAV3傾向于轉導巨核細胞；AAV5和AAV6對呼吸道上皮細胞有較高的轉導效率；AAV9由于其衣殼序列中的特異性氨基酸傾向于通過半乳糖與細胞結合，使其能夠跨越血腦屏障，傾向于感染中樞神經細胞；AAV8基因型更傾向于有效的轉導肝臟組織，這對于研究不同的疾病提供了方便性和可選性。

2 AAV載體的生產方式

AAV成為基因治療的載體之后，研究者們一直在不斷的摸索條件，以期得到一種穩定的生產體系。是否能夠方便、大量的獲得需要的AAV載體是滿足臨床實驗的關鍵，生產成本是否低廉決定了其應用和商業價值。目前，常用的載體制備方法主要有質粒轉染、構建穩定細胞系以及通過桿狀病毒表達系統表達，各有其優缺點(表1)。

2.1 質粒轉染

表1 AAV載體的生產方式Table 1 Production method of AAV vecter.

質粒轉染是通過質粒轉染加腺病毒感染或者質粒直接感染宿主細胞生產rAAV病毒粒子。早在1984年的兩個研究組首先采用了質粒轉染的方式來生產rAAV[12]，將兩個質粒，一個是攜帶AAV 基因組中的ITR序列及外源基因的載體質粒，另一個是攜帶rep、cap基因的包裝質粒，轉染由野生型腺相關病毒感染過的細胞，能夠大量表達外源基因；經過Samulsi的改進，用載體質粒和包裝質粒與腺病毒共同感染HEK293細胞，收獲rAAV粒子[13]；質粒轉染加腺病毒感染的方法改進之后的最高產量能夠達到109TU/mL(transducing units,TU轉導單位)[14]，由于易被野生型AAV污染，不便純化[15]， Xiao等[16]用三質粒表達系統生產rAAV，將輔助病毒的功能基因克隆進單獨的質粒中，與載體質粒和包裝質粒共同轉染HEK 293細胞，相比于傳統的質粒轉染系統，產量能夠達到103TU/cell[17,18]。

盡管質粒轉染的方法簡單易行，但該方法大規模應用時需要大量的宿主細胞，無法滿足臨床研究和市場需求的大批量生產，且質粒頻繁轉染會導致在傳代的過程中出現野生型AAV的污染，不易純化。

2.2 構建穩定細胞系

將AAV的rep、cap基因、攜帶ITR和目的基因的載體基因組和便于篩選的標記基因同時整合到細胞中構成細胞系，生產rAAV病毒粒子。1990年，Vicent等[19]首先建立了整合AAV基因組的細胞系，他們用只包含rep及cap基因的質粒轉染HeLa細胞，得到了幾個整合了低拷貝AAV基因組的細胞系，由于缺失了ITR，生產rAAV的能力較低；許多研究者采取其他策略來改進rAAV的生產，Gao等[20]構建了攜帶腺相關病毒載體成分的重組腺病毒，并用自身啟動子控制的含rep及cap基因的質粒轉染HeLa細胞建立包裝細胞系，然后通過輔助腺病毒和攜帶載體成分的重組腺相關病毒共同感染包裝細胞系，從而產生rAAV病毒粒子；Farson等[21]通過對載體和細胞培養條件進行優化，使宿主細胞適應無血清懸浮培養，最高可達15 L的規模，實現了較大規模的生產。

但在實際操作中，穩定細胞系的構建通常需要經過大量的篩選以及不斷的鑒定，而且需要嚴格的生產能力評估才能得到符合要求的細胞系，其操作復雜性限制了其走向工業化。

2.3 桿狀病毒表達系統

桿狀病毒表達系統(Baculovirusexpression vector system, BEVS) 因其強啟動子、可以對表達的蛋白進行加工修飾、且能夠擴大生產規模，很早就被用來進行rAAV的生產[22]，被 EMA 批準進入歐洲市場的 Glybera 就是用該系統生產的[4]，常用苜蓿銀紋夜蛾-桿狀病毒(AutographacalifornicaNucleopolyhedrovirus，AcNPV)表達系統和家蠶-桿狀病毒(BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV)表達系統。

2.3.1苜蓿銀紋夜蛾-桿狀病毒(AcNPV)表達系統 早在幾十年前，BEVS已被用于工業中大量生產重組蛋白，該表達系統被證明是一種經濟可行的平臺，開始用于生產rAAV病毒顆粒[23]。Urabe等[24]在2002年建立了三桿狀病毒表達系統，將rep、cap基因和rAAV的ITR序列及目的基因在草地貪夜蛾細胞系(Spodopterafrugiperdacell, sf細胞)中分別由不同的3種重組桿狀病毒載體來表達，且生產的病毒粒子結構、功能均正常，但是由于rep基因轉錄沖突的問題，整個生產系統不穩定，很難進行大規模生產；Smith等[25]進行改進，設計出二桿狀病毒包裝系統，此系統只包含rep、cap基因和目的基因兩個重組桿狀病毒載體，不僅能更好的保持桿狀病毒的穩定性，使得桿狀病毒在昆蟲細胞內復制的代數至少達到6代，同時還能提高了rAAV的生產效率；在此基礎上，Galibert 等[26]開發出的單桿狀病毒表達系統，將rep、cap基因和rAAV必需基因組分別插入AcNPV基因組的不同位點構建一個重組桿狀病毒，這樣用一個重組病毒即可制備一種AAV載體，極大地提高了rAAV的包裝效率。

但是，上述AcNPV-sf細胞表達系統由于細胞培養的成本偏高，導致病毒載體制備的價格昂貴。第一個商品化的AAV產品Glybera，它的單次治愈劑量的標價最初高達160萬美元；美國獲批的AAV產品Luxturna的銷售定價為85萬美元。所以生產成本是限制AAV作為基因治療載體的關鍵因素之一。

2.3.2家蠶-桿狀病毒(BmNPV)表達系統 用家蠶桿狀病毒表達系統生產rAAV是一個可行的選擇，從生產成本看，據報道，僅用 5 個蠶蛹的外源蛋白的表達量相當于1 L昆蟲細胞的表達量[27]，在家蠶幼蟲的血淋巴中各類基因的表達量分別是sf細胞表達量的幾十倍甚至上百倍[28～30]。生產成本比細胞低幾百倍，而且昆蟲細胞培養的成本遠遠高于家蠶飼養成本。從安全性來看，家蠶作為鱗翅目昆蟲，已經列入食品目錄，僵蠶作為我國傳統的名貴中藥，已經被列入衛生部中藥名錄，這些都表明用家蠶桿狀病毒表達系統生產rAAV的安全性是有保證的，且已成功利用三桿狀病毒表達系統包裝出rAAV，經過驗證，具有感染哺乳動物并驅動目的基因表達的能力，不僅具有AcNPV-sf系統的優點，而且表達量更高，生產成本低幾百倍[31]，所以BmNPV-家蠶桿狀病毒表達系統是一個潛力巨大的rAAV生產系統。

3 重組腺相關病毒在基因治療中的應用

基因治療相比于傳統藥物，具有較小的患者群體和潛在的治療效果。目前，很大一部分的基因治療針對的是罕見病，包括脂蛋白脂肪酶、人類遺傳性視網膜病變、血友病等等，已有超過2 000例的基因治療應用于臨床試驗，其中超過68%是應用病毒載體[32]。2007年1月1日-2019年3月20日，世界范圍內開展的rAAV相關的臨床試驗共有117項(http://clinicaltrials.gov/),每年批準的數量總體上呈現指數遞增趨勢(圖2)。并且rAAV所用載體的亞型也在增加，由單一的rAAV2擴展到了rAAV1、rAAV5、rAAV8、rAAV9型，其中以rAAV1、rAAV2、rAAV8型相關的臨床試驗居多，分別為12項、59項和16項，治療的疾病范圍擴展到艾滋病、癌癥、視網膜疾病、肌營養不良癥、心力衰竭、神經系統疾病以及其他一些基因缺陷疾病，約25種。隨著不同血清型以及各種變體的改造，AAV在基因治療中的應用越來越廣，為人類疾病的治療提供了新的思路。

圖2 rAAV相關臨床實驗情況Fig.2 Clinical trials related to rAAV.

目前已經有兩種與AAV相關的基因治療藥物獲批上市，包括Glybera和 Luxturna，是基因治療領域最先被批準的基因療法，是用于治療罕見病的一個歷史性開端。還有一項即將上市的基因治療藥物AMT-130，該藥是一個治療亨廷頓病的高度創新的方法。

2012年，基于AAV的商品Glybera被歐洲管理局(European Medicines Agency，EMA)批準用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥(lipoprotein lipase deficiency, LPLD)，成為第一個正式批準上市的人用AAV基因治療產品，脂蛋白脂肪酶缺乏癥是一種罕見的脂類代謝紊亂疾病，屬于常染色體隱性遺傳病，患者由于基因突變無法產生足夠的LPL分解乳糜顆粒，嚴重時會引發急性胰腺炎[33]。Glybera通過rAAV病毒載體將活性LPL基因整合進肌細胞基因組，使這些細胞能夠產生正常數量的LPL，但由于生產成本昂貴，售價仍高達120萬美元，2017年由于銷售情況堪憂，黯然退市。

2017年，美國食品與藥物管理局批準Luxturna 用于治療遺傳性視網膜疾病；該病是由于RPE65基因突變而導致的視覺功能減弱甚至喪失，Luxturna通過rAAV將正確的基因RPE65導入眼部，產生有功能的蛋白，恢復受損神經細胞的功能，從而恢復喪失的視力。Luxturna曾獲得美國FDA頒發的孤兒藥資格與突破性療法認定。但Luxturna定價為85萬美元，成為2017年在美國銷售最昂貴的藥物[34]。

2019年，AMT-130已被美國食品與藥物管理局(US Food and Drug Administration FDA)批準開始治療亨廷頓病(Huntington’s Disease，HD)的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究[35]。亨廷頓病是一種罕見的、致命的神經退行性遺傳疾病，是由常染色體顯性突變引起的，在亨廷頓基因的第一個外顯子中存在CAG三核苷酸的異常重復擴增，導致大腦中突變蛋白聚集，表現為精神功能障礙終至癡呆。影響美國和歐洲大約70 000人，成為罕見疾病領域最大的臨床未解難題之一。盡管病因明確，但目前仍然缺乏可行的有效治療或延緩其發病的治療方案，AMT-130使用rAAV載體將人工miRNA直接遞送到大腦中敲低亨廷頓蛋白基因，這代表了治療HD的高度創新和有前途的方法。

近年來，基因治療正處于繁榮發展的時期，基于AAV載體的治療在臨床上顯現了令人印象深刻的結果，應用也越來越廣泛。目前，大多數rAAV基因治療計劃集中于肝臟、橫紋肌和中樞神經系統，rAAV可以靶向肝臟治療各種疾病，包括血友病、家族性高膽固醇、鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥；也能夠針對肌肉疾病開發rAAV基因療法；在臨床開發中，針對中樞神經系統的rAAV用來治療脊髓型肌萎縮癥、多糖累積癥等影響中樞神經系統的疾病，然而總體上rAAV基因藥物的臨床研究仍處于發展階段，存在著如純化、大規模制備、安全性評估等問題， rAAV載體在臨床方面進一步發展需要考慮的問題是如何進一步提高其治療效果，隨著對rAAV研究的深入，會有更多、更安全的rAAV載體出現，具有廣闊的臨床應用前景。

4 展望

基因治療代表了治愈人類疾病的前沿技術之一，其中用rAAV作為載體的臨床實驗更是呈指數性增長，已有兩種rAAV相關的基因治療藥物被批準進入市場。AAV領域的不斷擴大將繼續推動基因治療藥物的開發，人類基因組計劃更是實現了對基因組近乎完整的注釋，使我們處于基因組學和基因治療時代的中間，研究者應充分利用rAAV基因治療的前景并克服當前挑戰，如生產成本較高等問題，其中家蠶桿狀病毒表達系統相比于其他載體制備方法安全性更高、生產成本更低，能夠為解決目前因成本過高而限制AAV載體在基因治療中應用的問題提供一種新思路，但其后續產品的純化技術還需進一步摸索。隨著rAAV在臨床上的不斷應用，未來會著重加強載體優化、改進生產方式及效率，為其更好的應用于基因治療打下基礎。