除草劑2,4-D降解菌株的分離、篩選與鑒定

栗旭陽, 黃麗玲, 郭倩楠, 高如雨, 張 維, 陳 明, 陸 偉, 周正富

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

除草劑主要應用于農業生產中雜草的控制和防除，是目前造成環境污染的主要途徑之一。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是人工合成的一種激素類的植物生長調節劑，高劑量2,4-D具有除草劑特性，廣泛應用于多種單子葉作物生產中，如水稻、小麥、高粱、甜蔗和玉米中來進行闊葉雜草的防除[1]。2,4-D是一種中等持久性化學物質，半衰期(T1/2)為20～312天[2,3]。近幾年，隨著2,4-D的使用量逐年增大，其對人類與環境造成的危害也逐年增加。噴施于地表的除草劑會滲透到土壤以及地下水中[4]，由于2,4-D的低吸附性和水中的高溶解性，2,4-D通常可以在地下水和地表水中被檢測到[5～7]。研究表明，地表殘留的2,4-D大約91.7%會進入到水中[8]。這將會對植物和動物的生長造成嚴重威脅。此外，除草劑也會通過河流等進入水體資源中，從而影響水生動植物的生存。

土壤中2,4-D的降解是一個逐步衰減過程，其受到非生物作用和生物作用的共同影響。不同的土壤成分以及微生物群落對2,4-D的降解起到了關鍵作用[9]。2,4-D 的生物降解過程已經通過降解菌株進行了詳細研究[10]。目前已報道的具有2,4-D降解能力的細菌菌株主要為α-、β-、γ-型變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌/綠菌門(Bacteroidetes/Chlorobi)[11]細菌。在變形菌門中，根據降解途徑及參與基因的不同分以下三類：第一類主要為生長較快的β-和γ-型變形菌門細菌，包括無色桿菌屬(Achromobacter)、產堿菌屬(Alcaligenes)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和多噬菌屬(Variovorax)等。其主要由α-酮戊二酸(α-KG)依賴型TfdA基因參與2,4-D降解的起始反應[12]。第二類主要為生長較慢的貧營養型α-變形菌門細菌，如慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)[11]等。主要由tfd-like和tfdAα基因參與2,4-D側鏈基團斷裂的起始反應，生成4-氯苯氧基乙酸。第三類也屬于α-變形菌門，主要包含鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、食酸代爾夫特菌屬(Delftia)和紅球菌屬(Rhodococcus)菌株，包含cadRABKC降解基因簇[13,14]。

目前細菌中的2,4-D降解途徑主要分為兩種。第一種為2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)降解途徑，即通過α-酮戊二酸依賴性2,4-D雙加氧酶(TfdA)，去除2,4-D側鏈基團生成2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)，隨后2,4-DCP通過2,4-DCP羥化酶(TfdB)羥化形成二氯鄰苯二酚，再依次通過鄰位裂解雙加氧酶(TfdC)、氯代環異構酶(TfdD)和氯代水解酶(TfdE)的作用，逐步代謝后進入三羧酸循環(TCA)；第二種代謝途徑為4-氯苯氧基乙酸降解途徑，通過利用2,4-D脫鹵素酶的脫氯作用，使2,4-D轉化為4-氯苯氧基乙酸，隨后依次通過2,4-DCP羥化酶、4-氯代雙加氧酶、氯粘蛋白環異構酶的作用下進入TCA循環[14]。目前多數研究表明2,4-D的細菌降解途徑中主要的初級代謝產物是2,4-DCP，且其除草毒性與2,4-D相比降低了近100倍。

國際上對于除草劑的微生物降解已有大量研究報道，主要圍繞降解菌株的分類篩選以及代謝途徑進行研究，但目前許多分離的降解菌株存在一定的局限性、代謝途徑的研究也不夠全面與徹底。近年研究顯示，土壤微生物中存在更多參與2,4-D降解的酶及其編碼基因，表明目前對于2,4-D生物降解的了解仍然有限，因此從土壤中分離高效降解菌株并研究其降解途徑，對新型降解功能基因的開發具有重要的理論及實際意義。本研究通過富集培養的方法，用以2,4-D為唯一碳源的無機鹽培養基從2,4-D污染土壤樣品中篩選2,4-D耐受以及降解菌株并分類，對降解能力以及初級代謝產物進行初步鑒定。為降解菌株中關鍵降解基因的克隆奠定了研究基礎，也為2,4-D殘留污染的生物修復以及轉基因作物育種提供了菌種和基因資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗土壤樣品采集于廣西省桂林市靈川縣(23°N 110°E)和江蘇省南京市中山陵(32°N 118°E)地區的農田，該地區長期施用草甘膦和2,4-D等除草劑。

1.2 實驗試劑

2,4-D母液：稱取1.600 g 2,4-D(分析純，純度99%)逐漸溶解于20 mL的色譜甲醇中，配制成80 g/L的母液。

其他試劑：20 mmol/L(pH 6.75)MOPS,200 μmol/L (NH4)2Fe(SO4)2,200 μmol/L維生素C酸鈉,緩沖液Buffer(pH 10.0),2% 4-氨基安替比林,8%鐵氰化鉀,2,4-DCP(100 mmol/L)，配制方法參考Itoh[11]等。

細菌DNA提取試劑盒(HiPure Bacterial DNA kit)購于Magen公司。

1.3 培養基及培養條件

無機鹽基礎培養基和微量金屬鹽培養基用于除草劑2,4-D耐受以及降解菌株的篩選和鑒定，其中無機鹽基礎培養基和微量金屬鹽培養基的配制參考衛亞紅等[15]的方法。LB培養基用于除草劑耐受菌株的培養和純化。30℃進行菌株的篩選與分離，每組設定3個平行。

1.4 2,4-D降解菌株的富集培養

取1 g土壤樣品，加入到20 mL含50 mg/L 2,4-D和50 mg/L葡萄糖的無機鹽培養基中，于30℃ 200 r/min 搖瓶培養5 d。吸取1 mL土壤培養基混合液繼續重復轉接2次，連續富集菌株。而后將培養基中2,4-D終濃度提高到100 mg/L，30℃ 200 r/min搖瓶培養，且以2,4-D為唯一碳源，轉接3～4次。

1.5 降解菌株的分離純化以及耐受菌株的篩選

吸取200 μL富集后的培養液上清涂布于不同2,4-D濃度梯度的無碳無機鹽培養基平板上，無機鹽培養基的2,4-D終濃度分別為1～8 g/L。30℃培養，挑取長勢良好的菌落在LB瓊脂培養基平板上反復劃線3次，純化為單菌落，收集單菌落保存于終濃度為20%的甘油中。

1.6 降解菌株的16S rDNA測定

將冷凍保藏菌株劃線接種于LB平板，30℃活化過夜。挑取單菌落接種于LB液體培養基，30℃ 200 r/min培養，提取篩選菌株的基因組DNA。利用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增測序分析，EZbiocloud網站進行序列比對，鑒定菌株種屬。基因組DNA的提取方法均按常規方法操作[16]。

1.7 降解菌株代謝產物中2,4-DCP的檢測

2,4-DCP標準曲線的測定方法見Itoh[11]等。利用MOPS/MSM溶液制備2,4-DCP標準品溶液，終濃度分別為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L。分別取不同濃度的2,4-DCP標準品150 μL，依次加入15 μL Buffer(pH 10.0)、1.5 μL 4-氨基安替比林、1.5 μL鐵氰化鉀，反應10～15 min，測定OD510，繪制標準曲線。

將菌株轉接于以2,4-D為唯一碳源且終濃度為50 mg/L的MSM培養基中，30℃ 200 r/min搖瓶培養3～4 d，以24 h為時間間隔進行取樣，分別測定其OD600、4-aminoantipyrine method顯色反應條件下的OD510，即取150 μL菌液加入反應液，反應10～15 min后測定OD510，通過顯色反應實驗測定2,4-DCP生成量。同時取樣5 mL進行HPLC檢測菌株降解能力，取樣1 mL進行LC/MS檢測其可能的代謝產物。通過在MSM無機鹽培養基和MOPS溶液中測定標準品在不同濃度梯度下的吸光值，繪制標準曲線。通過OD510的測定計算菌株培養液中2,4-DCP的含量變化情況，從而計算2,4-D的轉化效率及其降解能力。

1.8 高效液相色譜法檢測菌株對2,4-D的降解能力

取樣5 mL，加入等體積乙酸乙酯混勻，靜置幾分鐘，吸取上層溶液，離心濃縮蒸干后，用甲醇：水=1∶1(V/V)溶液溶解并定容到5 mL，取樣進行HPLC檢測。流動相溶液為乙腈:水(含0.5%冰乙酸)=60∶40(V/V)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：λ=230 nm，柱溫：40℃。

1.9 代謝產物初步分析

利用LC-QTOF對具有2,4-D降解能力的菌株進行檢測，取樣1 mL 12 000 r/min 離心10 min，再通過0.22 μm孔徑濾膜后上樣檢測分析。利用LC-QQQ全掃描質譜通過提取差異峰并與2,4-D、2,4-DCP標準品比較，推測初級代謝產物結構。

2 結果與分析

2.1 降解菌株的篩選和分離

通過以2,4-D為唯一碳源的無機鹽培養基進行富集培養，觀察其菌落形態。共分離得到85株菌，提取菌株基因組DNA進行菌株的16S rDNA序列測定與菌種鑒定分析。

2.2 功能菌株的16S rDNA序列分析以及2,4-D耐受能力分類

將篩選菌株的16S rDNA序列在EZbiocloud上進行序列比對分析，同時將篩選分離得到的功能菌株涂布于以不同濃度2,4-D為唯一碳源的無機鹽固體培養基上進行耐受能力的分類測定，整理分離的85株菌株的種屬信息以及耐受能力如表1所示，各種屬菌株數量及所占比例如圖1所示，由圖1和表1分析可知，分離篩選到85株菌分屬于13種屬，包括23株假單胞菌(Pseudomonassp.)、16株芽孢桿菌(Bacillussp.)、7株賴氨酸桿菌(Lysinibacillussp.)、5株類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)、19株短桿菌(Brevibacillussp.)、2株沙雷氏菌(Serratiasp.)、2株甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)、5株貪銅菌(Cupriavidussp.)、1株紅球菌(Rhodococcussp.)、 2株拉恩氏菌(Rahnellasp.) 、1株葡萄球菌(Staphylococcussp.)、1株阿氏腸桿菌 (Enterobactersp.)、1株分支桿菌 (Mycobacteriumsp.)。耐受較高2,4-D濃度的菌株主要為假單胞菌 (Pseudomonassp.)，少量為阿氏腸桿菌(Enterobactersp.)、貪銅菌 (Cupriavidussp.)和類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌所占比例最大，耐受能力普遍較高(1～8 g/L)。

表1 除草劑2,4-D分離菌株種屬鑒定及耐受能力分類Table 1 The identification and classification of 2,4-D tolerant strains.

注：不同數量“+”所代表耐受濃度分別為：“+”: 100 mg/L～1 g/L; “++”: 1～3 g/L; “+++”: 4～6 g/L; “++++”: 7～8 g/L。

圖1 2,4-D耐受菌株種屬分類Fig.1 Classification of strains corresponding to the 2,4-D tolerance.

2.3 菌株初級代謝產物2,4-DCP的測定

分別在MSM無機鹽培養基和MOPS中測定標準品在不同濃度梯度下的吸光值，建立標準曲線。如圖2所示，通過以24 h為時間間隔測定OD510，分析各菌株培養液中2,4-DCP含量。實驗結果顯示，已進行測定的菌株中，有11株菌培養液中2,4-DCP含量較高，其中最高的4株菌測定結果如表2所示。

2.4 菌株2,4-D降解能力測定

對以上4株功能菌株的降解能力進行檢測，以不加菌株的無機鹽培養基(2,4-D終濃度為50 mg/L)作為對照，利用HPLC進行檢測。以相同時間間隔取樣測定OD600，分析菌株生長情況，同時取樣進行HPLC檢測，根據液相色譜圖峰值積分可計算培養72 h后的2,4-D的利用率。測定結果如圖3所示，由圖可知菌株在2,4-D為唯一碳源的培養基中生長良好，且隨著培養時間的增加，培養基中的2,4-D含量逐漸降低，其中培養72 h后菌株不再生長，根據HPLC檢測的積分結果計算可知菌株L1、L2、L4和L6在培養72 h后2,4-D的利用率分別為17.3%、38.97%、49.02%和28.07%。

圖2 2,4-DCP標準曲線Fig.2 The standard curve of 2,4-DCP.A: MSM無機鹽培養基中的標準曲線; B:MOPS培養基中的標準曲線。

時間(h)04812162432364048546072CK0.020.1040.1030.100.1100.1130.110.110.100.0090.0090.100.11L10.050.0550.130.1350.160.210.360.650.455004050.2950.340.355L20.040.110.1250.3850.450.5150.620.7350.610.5150.390.430.425L40.0520.010.250.3350.4220.6450.7250.7750.5250.4150.2050.340.37L60.0630.01150.1050.2750.3150.430.530.6050.5150.390.190.2950.35

2.5 菌株降解產物初步分析

2.5.12,4-D標準曲線的測定 優化2,4-D的LC-MS檢測條件，標準曲線和標準品色譜圖如圖4所示。

2.5.2LC-MS-QTOF檢測結果分析 利用MRM模式以兩對離子對為參照，對以上4株菌株進行檢測。根據質譜圖分析可知色譜圖中兩個定性離子對峰面積相對于CK均有一定程度的降低。繼續進行LC-MS-QTOF全掃描檢測其可能的代謝產物及結構，提取差異峰分子量如表3所示，由表3可知紅色部分為四種主要的成分分子量，分別為89.006 3、124.983 7、160.960 9 和218.968 3，利用Chemisketch、Pubchem軟件計算并推測其主要化學結構(表4)，由于LC-MS-QTOF負離子模式檢測，推測可知4種主要代謝產物分別為苯酚、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。

由表4可知，4株功能菌株培養液的質譜檢測結果中2,4-DCP的色譜峰均為除2,4-D外的差異峰主峰，因此推測4株功能菌株降解2,4-D的主要途徑為2,4-DCP。同時在L1、L4和L6培養液中還分別存在苯酚、4-氯苯氧基乙酸成分峰，由此推測上述菌株中不僅存在2,4-DCP降解途徑，同時也可能存在脫鹵降解途徑，這一結果還需進一步驗證。

2.6 降解菌株系統進化分析

對篩選得到的4株降解菌株的16S rDNA序列進行功能進化分析，菌株的系統發育進化樹如圖5～8所示。菌株L1、L2、L4和L6分屬于阿氏腸桿菌屬(Enterobacter)、 紅球菌屬(Rhodococcus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。通過進行同源性分析，菌株L1為阿氏腸桿菌屬(Enterobacter)，與菌株Enterobacterasburiae具有較高的同源性(98.87%)，菌株L2為紅球菌屬，與菌株Rhodococcuskroppenstedti具有較高同源性(98.2%)，菌株L4為貪銅菌屬，與菌株Cupriaviduspampae具有較高同源性(97.93%)，菌株L6為假單胞菌屬，與菌株Pseudomonasputida具有最高同源性(98.92%)。研究表明，紅球菌屬、貪銅菌屬和假單胞菌屬均被報道具有除草劑及多苯環芳香烴降解能力，推測其中含有除草劑降解基因。

3 討論

本文共分離篩選到85株菌，16S rDNA分析顯示，這些菌分屬13個種屬，表明經過2,4-D長期馴化后田間土壤中廣泛存在2,4-D耐受(降解)菌株。近年來又發現多種降解菌株：2012年分離到的代爾夫特菌屬(Delfitia)菌株可以在24 h內降解100 mg/L 2,4-D[17]；2014年和2015年分別于日本、北京和阿根廷分離到3株具有2,4-D降解能力的貪銅菌屬(Cupriavidus)細菌，分別命名為：Cupriavidussp. CY-1[18]、CupriaviduscampinensisBJ71[19]和Cupriavidusnecatorstrain N-1[20]；2015年分離到新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumstrain DY4)，可在5 d內能夠降解2,4-D[21]；2016年González等[22]報道伯克霍爾德菌(Burkholderia)和分支桿菌屬(Mycobacterium)細菌具有2,4-D降解能力；已報道在土壤和活性污泥的混合物中分離到兩株無色桿菌屬(Achromobacter)細菌能夠在18 d內降解144mg/L的2,4-D[23,24]。

本實驗篩選所得的2,4-D耐受菌株中亦含有多株假單胞菌屬(Pseudomonas)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和分支桿菌屬(Mycobacterium)的細菌，推測以上3個種屬細菌可能含有具有2,4-D降解能

圖3 功能菌株的生長情況和2,4-D降解能力測定Fig.3 The growth curve and the degradation ability of 2,4-D.注：A,C,E,G:分別為菌株L1、L2、L4、L6的生長情況；B,D,F,H:分別為菌株L1、L2、L4和L6對2,4-D的降解能力測定。

圖4 2,4-D標準曲線和標準品色譜圖Fig.4 The 2,4-D standard curve and chromatogram.注：A: 2,4-D標準曲線；B: 1 000 bbp 2,4-D標準品色譜圖。

菌株名稱保留時間(min)提取代謝產物分子量L12.11889.0063225.1671233.1116239.1488241.09016.619115.9237160.9609218.9675303.9494514.3388583.2965L22.144153.0708165.9835233.1116.545115.9242160.9615218.9683514.3399583.2961L42.14589.0035233.11123.245115.9228124.9837195.1193226.167241.1617323.127429.20226.212115.5244160.9613218.9689514.3359583.2973L61.79124.969164.0731475.2536528.16536.074115.9242160.9611218.9683303.9482514.3406583.2966

表4 降解菌株代謝產物化學結構分析Table 4 The possible structure of metabolite from functional strains.

圖5 菌株L1的系統進化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of strains L1.

圖6 菌株L2的系統進化樹分析Fig.6 Phylogenetic analysis of strains L2.

力的酶和基因。同時，根據菌株耐受實驗結果可知，假單胞菌屬具有較強的除草劑耐受能力，目前已有研究報道，假單胞菌是一種易于接受質粒轉移的細菌，其中菌株Pseudomonasputida中存在pJP4質粒，該質粒能夠以多種微生物作為受體進行轉移，是一類廣宿主且具有自轉移能力的質粒[25,26]。 Aspray等[27]對pJP4質粒在污染土壤中的轉移情況進行了研究,發現pJP4質粒主要轉移到伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)中，其均含有具有2,4-D降解能力的tfd基因簇[28]，因此推測在2,4-D持續選擇壓力下，降解質粒轉移是導致土壤中假單胞菌具備2,4-D降解能力的主要原因。目前已有研究報道假單胞菌是一種易于接受質粒轉移的細菌，其中Pseudomonasputida攜帶質粒 pJP4，pJP4質粒能夠以多種微生物作為受體進行轉移，是一類廣宿主且具有自轉移能力的質粒[29,30]。 Aspray 等[ 31]對 pJP4質粒在污染土壤中的轉移情況進行研究, 發現 pJP4質 粒 主 要 轉 移 到Burkholderia、Ralstonia和Pseudomonas菌屬中。其上含有編碼2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)降解功能的基因簇(tfd)，因此推測在2,4-D持續選擇壓力下，降解質粒轉移是導致土壤中假單胞菌具備2,4-D降解能力的主要原因。

圖7 菌株L4的系統進化樹分析Fig.7 Phylogenetic analysis of strains L4.

圖8 菌株L6的系統進化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of strains L6.

通過初級代謝產物測定實驗共分離到4株降解菌株，其分屬于阿氏腸桿菌屬(Enterobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。目前已經有相關文獻報道：假單胞菌屬細菌可降解苯酚[32]、2,4-D、氯酚[33]、烷基磺酸鹽[34]、多環芳烴[35]、甲苯[36]和苯氧乙酸[37]等；紅球菌屬細菌可降解氯代硝基苯[38]和二噁英[39]等；近年來已有較多文獻報道貪銅菌屬細菌具有較強的芳香族烴類除草劑降解特性[40]。但菌株L1為阿氏腸桿菌屬細菌，本研究可知其具有較高的2,4-D耐受能力，但目前并未有文獻報道其具有除草劑降解能力，對該菌降解2,4-D的代謝途徑及相關基因還需進一步研究。

2,4-D導致的土壤污染給環境污染防治工作帶來了新的挑戰，同時也促進了環境微生物修復技術的發展。目前大量研究表明利用土壤微生物對2,4-D進行降解可以有效的解決除草劑污染問題，同時利用生物技術方法對具有降解2,4-D潛能的微生物進行基因改造，這不僅可以增強對環境中污染物的降解能力，同時也為2,4-D殘留污染的生物修復以及轉基因作物育種提供菌種和基因資源。