玉米PHYB1基因的克隆、改造及其在擬南芥中的功能分析

馬曉凈, 趙斌斌, 劉 揚, 馬夢迪, 王海洋

1.中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081; 2.中國農業科學院研究生院, 北京100081; 3.華南農業大學生命科學學院, 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室, 廣州 510642

對于植物而言，光是重要的能量來源及環境信號，幾乎貫穿于植物的一生，對于植物的生長發育極其重要[1]。植物主要依靠四類光受體感知光的變化，其中以紅光(R)及遠紅光(FR)(600～750 nm)受體——光敏色素(phytochromes, phys)的研究最為透徹。光敏色素是含有一個線性四吡咯發色團的同源二聚體，單體約120 kDa[2]。phyB在植物體內以兩種可逆狀態存在，即有活性的FR吸收態——Pfr和非活性的R吸收態——Pr[3]。其通過與光敏色素互作因子(phytochrome interacting factors, PIFs)互作來行使其功能[4～7]。Nito等[8]認為將擬南芥PHYB的104位酪氨酸(Y)殘基改造為苯丙氨酸(F)殘基可使其對紅光超敏感。Zhang等[9]研究表明，將擬南芥PHYB N端361位的酪氨酸(Y)殘基突變為苯丙氨酸(F)殘基可增強其活性。

同時，光敏色素B還是避蔭反應的抑制因子[10]。避蔭反應是一個十分復雜的過程[11～12]，通常認為紅光與遠紅光的比例(R:FR)下降是觸發避蔭反應的因素。密植后(遮陰)植物之間相互遮擋，由于植物葉片對有效光的截留、吸收及反射等影響導致底層紅光與遠紅光比例下降(低R:FR)，而影響植物的光合作用。在低R:FR生長條件下，擬南芥表現為莖和葉柄伸長、葉片上翹、葉面積變小、分枝減少、早花、根系弱、易感病、抗逆性減弱等適應性特征，這些反應統稱為避蔭反應(shade avoidance response, SAR)[13～15]。

在低R:FR生長條件下，單子葉植物也會出現莖稈徒長、分蘗顯著減少、產量下降、易倒伏、雌雄間隔增大等特征。并且玉米中的phyB1phyB2雙突變體和高粱中的phyB突變體與擬南芥中的phyB突變體類似，均表現出避蔭反應的特征，如植株增高、節間增長、易倒伏、分蘗減少、早花等[16～19]。這一結果表明，phyB也是禾本科植物中調控避蔭反應的主要光受體[20]。目前擬南芥中遮蔭反應分子機理的研究已經相當完善，但在禾本科植物中的研究還十分有限[19]。因此研究玉米的光敏色素B對于了解玉米避蔭反應及光敏色素在單、雙子葉植物避蔭反應中的功能差異十分重要。

玉米(ZeamaysL.)由于廣適性、高產、用途多樣等特點，在全球范圍內被廣泛種植。2012年玉米已成為我國第一大谷物。研究表明[21]，我國玉米單產水平與美國等國家相去甚遠。Duvick等[22]研究發現增加單位面積玉米的種植密度以增加果穗數是提高玉米單產的有效途徑，但目前我國玉米的種植密度僅為美國的60%左右。因此，我國在玉米種植密度上還有很大的提升空間。但在高密度種植情況下，避蔭反應綜合征是限制玉米產量提高的主要因素，因此解析避蔭反應關鍵基因光敏色素的功能，對于深入了解玉米光信號遺傳網絡、指導玉米新品種培育具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 玉米自交系B73、擬南芥野生型Col-0、擬南芥突變體phyB-9、本生煙草(N.benthamiana)為本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態、農桿菌GV3101感受態、P19菌株、AT-Hook菌株為本實驗室保存；改造后的pCAMBIA載體為本實驗室保存。

1.1.2實驗試劑 快速質粒小提試劑盒(DP105-03)、反轉錄試劑盒(KR106-02)、通用型DNA純化回收試劑盒(DP214-03)、熒光定量試劑盒(FP205-02)購于天根生化科技公司；Trizol試劑盒購于賽默飛世爾試劑公司；限制性內切酶購于TaKaRa公司和NEB公司；In-fusion HD Cloning Kit購于Clontech公司；KOD Fx PCR擴增酶購于ToYoBo公司等。

1.1.3實驗儀器 TC-XP型PCR儀購于廣州博日科技公司；Quant Studio 3實時定量PCR儀購于ABI公司；Tanon-100一體化凝膠成像系統購于上海天能公司；低溫離心機購于Eppendorf公司；NANO DROP 2000C購于Thermo公司；三色光植物培養箱購于PERCIVA公司；Stemi 508型體視顯微鏡購于蔡司公司；LB985型植物活體成像儀購于Berthold Technologies公司等。

1.2 方法

1.2.1序列獲得 在Tair數據庫(https://www.arabidopsis.org/)和MaizeGDB數據庫(https://www.maizegdb.org/)中下載擬南芥及玉米光敏色素蛋白質序列。

1.2.2組織表達分析 利用Trizol法提取RNA；反轉錄(詳見天根反轉錄試劑盒(KR106-02)說明書)；轉基因株系中外源基因ZmPHYB1的表達量檢測利用引物qPHYB1-F/R(表1)，內參引物參考Liu等[23]的引物序列，進行實時定量PCR(操作詳見天根熒光定量試劑盒(FP205-02)說明書)。

1.2.3ZmPHYB1序列的克隆及改造 利用CTAB法[24]提取DNA，RNA提取同1.2.2。在MaizeGDB數據庫(https://www.maizegdb.org/)中檢索PHYB1(GRMZM2G124532)基因并下載其序列信息，設計克隆及位點改造所需的引物(引物序列見表1)。ZmPHYB1啟動子(pZmPHYB1)由引物ZmPHYB1-pro-F/ZmPHYB1-pro-R以自交系B73基因組DNA為模板進行克隆；野生型ZmPHYB1(ZmPHYB1WT)編碼序列(CDS)由引物ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-R以自交系B73的cDNA為模板克隆。為了得到序列ZmPHYB1Y98F，ZmPHYB1Y359F(兩個位點的確定詳見2.1)，通過重疊PCR的方法進行克隆。具體操作如下：以ZmPHYB1WT為模板，利用引物ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-98-R和ZmPHYB1-98-F/ZmPHYB1-R，分別進行富集，純化回收，混合后作為模板。再以ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-R進行重疊PCR，獲得ZmPHYB1Y98F；以同樣的方法獲得ZmPHYB1Y359F。

1.2.4轉基因及鑒定 將pZmPHYB1與ZmPHYB1WT、ZmPHYB1Y98F及ZmPHYB1Y359F分別融合，與改造后的pCAMBIA載體重組獲得重組子。將重組質粒轉入擬南芥中研究其功能。轉基因采用擬南芥花序浸染法[25]；轉基因陽性植株的鑒定采用噴灑Basta篩選法及特異引物PCR檢測法。特異引物PCR檢測法具體操作如下，提取轉基因擬南芥基因組DNA為模板，以鑒定引物ZmPHYB1-identify-FP/RP(表1)進行PCR擴增，若為陽性植株則可見1.4 kb大小條帶，陰性植株則無此條帶。

1.2.5表型統計及分析 主要觀測的表型包括下胚軸長度、葉柄長度、葉片長度等。每個材料取30株進行表型的測量及統計，采用t測驗(Student’sttest)進行顯著性分析。下胚軸長度測量：人工氣候室(光照/黑暗:16 h/8 h)培養6～7 d后，體視顯微鏡下觀察、拍照；用Image J軟件測量30株幼苗的下胚軸，統計分析；葉柄長度及葉片長度測量：取在長日照條件下生長2～3周材料的第3、4片葉，相機拍照；Image J軟件測量30個單株的葉柄長度及葉片長度，統計分析。

1.2.6蛋白互作研究 采用熒光素酶互補成像(firefly luciferase complementation imaging assay, LCI)實驗[23]進行驗證。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers for the study.

2 結果與分析

2.1 玉米PHYB1改造位點的確定

已有研究發現，把擬南芥PHYB的104位與361位的酪氨酸(Y)殘基改造為苯丙氨酸(F)殘基可以提高擬南芥phyB的活性[8,9]。下載擬南芥、玉米、水稻、大豆、高粱等的PHYB全蛋白序列進行比對。結果如圖1所示，通過序列比對，我們發現在以上物種中，這兩個位點十分保守。最終我們確定玉米中的98位和359位酪氨酸(Y)殘基分別與擬南芥中104位和361位酪氨酸(Y)殘基相對應。

圖1 氨基酸突變位點Fig.1 Amino acid mutation sites.ZmPHYB1：玉米PHYB1；SbPHYB：高粱PHYB；ZmPHYB2:玉米PHYB2；OsPHYB：水稻PHYB；AtPHYB：擬南芥PHYB；GmPHYB：大豆PHYB。

2.2 轉基因單拷貝純合株系的篩選

將構建好的pZmPHYB1∷ZmPHYB1WT，pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y98F和pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y359F三種重組子分別轉入擬南芥phyB-9突變體中。采用噴灑Basta溶液的方法，篩選陽性植株。最終得到單基因插入的純合轉基因植株，收取種子待用。為了確定轉基因純合株系的真實性，對以上植株進行PCR鑒定。陽性轉基因植株可見

1.4 kb的條帶，而野生型(Col-0)及phyB-9無該條帶，如圖2。通過以上實驗結果我們最終得到了確切的單基因插入的轉基因純合株系。

圖2 PCR鑒定陽性轉基因株系Fig.2 PCR identification of positive lines.

2.3 表達分析

為了得到ZmPHYB1基因的表達圖譜，在線搜索了ZmPHYB1的RNA-Seq數據[26]，并對數據進行分析，結果如圖3A所示；同時針對2.2中得到的純合轉基因株系我們還進行了外源基因ZmPHYB1的實時定量PCR檢測，結果如圖3B所示。通過以上結果發現，ZmPHYB1基因在根、莖(節間)、葉、頂端分生組織(SAM)、雄穗、花絲等組織中均有表達，但主要在葉子中表達，尤其是在V9時期的第13片葉及未成熟葉片中表達量最高。此結果與光敏色素基因光受體的功能相符。由圖3B還可以發現，在轉基因株系中，轉入的外源ZmPHYB1可在phyB-9突變體中表達。

圖3 ZmPHYB1基因的表達情況 Fig.3 The expression of ZmPHYB1.A.ZmPHYB1基因在玉米不同組織中的表達情況；B.擬南芥各轉基因株系中ZmPHYB1的表達水平。WT#1/2、Y98F#16/24、Y359F#3/12名稱中“#”后面的數字表示轉基因株系編號。

2.4 轉基因擬南芥植株表型分析

2.4.1轉基因株系下胚軸長度統計分析 如圖4A所示，phyB-9突變體的下胚軸顯著長于各轉基因株系及野生型。圖4B中統計數據也同樣證實上述結果。對以上結果進行分析可以得出：①轉入外源基因ZmPHYB1可以使phyB-9突變體的下胚軸長度部分或完全恢復到野生型水平，即抑制突變體下胚軸伸長；②經過位點改造的轉基因株系的下胚軸短于未經過位點改造的轉基因株系。綜上所述，ZmPHYB1與擬南芥中phyB具有相似的功能。并且Y98F和Y359F氨基酸的替換可增強ZmPHYB1的活性，此結果與前人在擬南芥中的研究相符[8]。

圖4 轉基因株系表型Fig.4 Phenotype of transgenic lines.注：A.長日照條件下生長6天的植株的表型；B.長日照條件下生長兩周的葉片形態；C.長日照條件下，下胚軸長度的測量及統計；D.長日照條件下，第三、四片真葉葉片長度的測量及統計；E.長日照條件下，第三、四片真葉葉柄長度的測量及統計。標尺為1 mm；**表示突變體phyB-9與各株系之間在P<0.01水平上差異顯著(t檢驗，n=30)。

2.4.2轉基因株系葉片長度與葉柄長度統計分析 在長日照生長條件下，phyB-9突變體一般只有4片蓮座葉且其葉片及葉柄顯著伸長，因此我們選取Col-0、phyB-9、轉基因株系的第3、4片葉，對其葉片長度、葉柄長度進行統計，如圖4C-E所示。從以上結果可以看出，轉基因株系的葉片長度及葉柄長度均顯著短于突變體phyB-9，即在擬南芥phyB-9突變體中轉入外源ZmPHYB1后，轉基因材料的葉片及葉柄變短。由此可見，ZmPHYB1可以抑制phyB-9突變體的伸長反應(下胚軸、葉片及葉柄的伸長)，這說明該基因可能是避蔭反應的抑制因子。

2.5 ZmPHYB1與AtPIF5互作

研究表明，擬南芥的phyB可以直接與光敏色素互作因子(PIFs)互作[5]。前期實驗表明，ZmPHYB1與擬南芥phyB在功能上存在一定的保守性。推測其通過與擬南芥PIFs互作而行使功能。借助熒光素酶互補成像技術，可驗證玉米PHYB1是否與擬南芥PIFs互作。選取AtPIF5為代表進行驗證。結果顯示，三種形式的ZmPHYB1(PHYB1WT、PHYB1Y98F、PHYB1Y359F)均可以與AtPIF5互作(圖5)，表明ZmPHYB1在擬南芥中可與AtPIF5互作，進一步驗證了ZmPHYB1與擬南芥PhyB在功能上的保守性。

2.6 轉基因株系中避蔭反應響應基因及生長素合成關鍵基因的表達模式

phyB是擬南芥中響應避蔭反應的主要光受體，為了驗證ZmPHYB1是否參與擬南芥的避蔭反應，我們對避蔭反應信號通路中的一些重要響應基因的表達量進行了檢測。如圖6所示，通過qRT-PCR檢測避蔭反應中的marker基因(ATHB2)與生長素合成marker基因(YUC5)在轉基因株系中的表達模式，對結果分析可以看出，擬南芥轉基因株系中ATHB2及YUC5的表達量均顯著低于phyB-9突變體中的表達量，但均高于野生型，這也從一個側面解釋了我們的轉基因株系為什么不能完全互補phyB-9突變體表型。以上結果進一步表明ZmPHYB1在擬南芥中可以行使PHYB的功能——抑制伸長反應。

圖5 LCI驗證ZmPHYB1與AtPIF5互作Fig.5 LCI verifies the interaction between ZmPHYB1 and AtPIF5.

圖6 下游響應基因表達分析Fig.6 Expression analysis of downstream shade responsive genes.A.ATHB2表達量變化；B.YUC5表達量變化。*和**表示突變體phyB-9與各株系之間在P<0.05和P<0.01的水平上差異顯著(t檢驗)。

3 討論

在雙子葉模式植物擬南芥中PHYB具有抑制避蔭反應的功能[27～29]。在禾本科植物中PHYB也是調控避蔭反應的主要光受體，但其在玉米避蔭反應調控的遺傳網絡和分子機理鮮有研究[19,30～31]。本研究表明ZmPHYB1與擬南芥PhyB存在功能保守性，并且ZmPHYB1可以參與調控擬南芥的避蔭反應。

作物的避蔭反應是一種適應性反應，但其對農業生產十分不利。育種家經過不斷地實踐和總結，提出作物耐密理想株型以減弱或消除避蔭反應。理想株型指標包括小雄穗、堅莖稈、株高適宜等[32]。張世煌[33]指出，高密度育種的首要目標在于增強自交系和雜交種的耐密植等抗逆性。研究表明[34]，玉米的莖稈徒長(株高增加)是玉米避蔭反應綜合征的典型特征。此外，避蔭反應所導致的植株徒長還會加重倒伏的發生以及減產[35]。陳德龍[36]認為，株高和穗位高與倒伏是高度正相關的。本研究結果表明ZmPHYB1可以抑制擬南芥的伸長反應，故而推測在轉基因玉米中同樣會出現株高降低、穗位高降低等表型。擬南芥Y104F(對應玉米Y98F突變)氨基酸的替換可增加植株對紅光的敏感性[8]，因此推測玉米Y98F氨基酸的替換也可以使玉米對紅光超敏，進而減弱由于密植造成的避蔭反應。擬南芥Y361F(對應玉米Y359F突變)氨基酸的替換，可以加速PhyB由非活性形式轉變為活性形式[9]，因此在Y359F殘基替換的轉基因株系中PhyB的活性形式積累，降解避蔭反應促進因子——PIFs，增強了玉米的耐密性。

總之，本研究為耐密植玉米新品種的培育提供了參考，同時也可以啟發育種工作者篩選這兩個位點的自然變異，以改良玉米的株高、穗位高以及增強耐密性。