基于超聲成像技術(shù)的冷鮮與解凍牛肉鑒別方法

孫宗保 王天真 鄒小波 閆曉靜 梁黎明 劉小裕

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013)

0 引言

牛肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國牛肉的消費(fèi)需求量逐年增加，同時(shí)人們對牛肉的品質(zhì)要求也不斷提高[2]。我國肉牛行業(yè)起步較晚、起點(diǎn)較低，高檔牛肉消費(fèi)需求主要以進(jìn)口為主[3]。冷鮮牛肉和冷凍牛肉是現(xiàn)階段我國主要的牛肉進(jìn)口形式。冷凍牛肉在冷凍過程中由于冰晶生長，細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)遭到機(jī)械擠壓和破壞[4]，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，肉的膠體性質(zhì)被破壞；在解凍過程中，肉內(nèi)汁液大量流失，造成肉品食用品質(zhì)下降[5]。而冷鮮牛肉從加工到銷售始終處于冷鏈控制下，酶的活性和大多數(shù)微生物的生長繁殖被抑制，并且冷鮮牛肉經(jīng)歷了較為充分的成熟過程，肉的嫩度增加，肉質(zhì)得到改善，滋味鮮美。通常情況下，冷鮮牛肉比同類冷凍牛肉貨架期短，價(jià)格也高。近年來，有不法商販將冷凍牛肉解凍后充當(dāng)冷鮮牛肉販賣，從中獲取非法利益，消費(fèi)者從感官上難以辨別。因此有必要對冷鮮與解凍牛肉進(jìn)行有效的區(qū)分。目前鑒別冷鮮和解凍肉的方法有酶法、DNA法、光譜法、生物成像法和感官評價(jià)法等[6]，這些方法存在有損、耗時(shí)或片面不直觀的缺點(diǎn)，所以有必要研究一種全面直觀、無損快速的檢測方法。

超聲波是指超出人耳聽力范圍的機(jī)械波(頻率20 kHz以上)[7]，根據(jù)能量水平可分為高能量超聲波和低能量超聲波。高能量超聲波常用于清洗[8]和強(qiáng)化輔助[9]，低能量超聲波常用于檢測[10]和診斷[11]。當(dāng)超聲波傳經(jīng)兩種聲阻抗不同的相鄰介質(zhì)的界面時(shí)，會(huì)發(fā)生反射和折射。超聲成像設(shè)備利用傳感器收集處理超聲波在待測物質(zhì)中傳播產(chǎn)生的反射回波，在計(jì)算機(jī)上形成圖像，通過圖像可對待測物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)作出評價(jià)。超聲成像技術(shù)作為一項(xiàng)準(zhǔn)確、快速的無損檢測技術(shù)，目前廣泛運(yùn)用于醫(yī)療診斷[11-12]、工業(yè)檢測[13-14]等領(lǐng)域。文獻(xiàn)[15]通過采集分析超聲圖像，利用超聲成像技術(shù)成功鑒別大西洋鮭早期性別和發(fā)育期，為超聲成像技術(shù)在魚類養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。而超聲成像技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道較少。文獻(xiàn)[16]通過插值法等方法處理優(yōu)化因衍射和折射效應(yīng)發(fā)生扭曲的超聲圖像，成功檢出干酪和雞肉中異物。解凍牛肉經(jīng)冷凍又解凍的過程，質(zhì)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化[17]，因此可以通過牛肉的質(zhì)構(gòu)信息對牛肉品質(zhì)作出評價(jià)。文獻(xiàn)[18]分別測定了冷鮮和解凍牛肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)和新鮮度指標(biāo)，建立了牛肉質(zhì)構(gòu)參數(shù)與新鮮度之間的關(guān)系。超聲成像技術(shù)可以獲得待測物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)聲學(xué)特性的信息[19]，不同質(zhì)構(gòu)特性的牛肉對超聲波反射強(qiáng)度不同，故可以通過對冷鮮與解凍牛肉超聲圖像的采集處理，進(jìn)行冷鮮和解凍牛肉質(zhì)構(gòu)分析和鑒別。

本文利用超聲成像技術(shù)采集冷鮮與解凍牛肉的超聲圖像，結(jié)合質(zhì)構(gòu)參數(shù)、微觀結(jié)構(gòu)和部分理化指標(biāo)分析圖像差異的成因，用灰度共生矩陣法提取圖像的紋理特征變量，建立線性判別分析和支持向量機(jī)模型，對冷鮮與解凍牛肉進(jìn)行判別，以期為超聲成像技術(shù)在冷鮮與解凍牛肉判別方面的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

試驗(yàn)所用樣本產(chǎn)地均為澳大利亞，活牛在澳大利亞宰殺分割包裝后空運(yùn)至國內(nèi)，再通過冷藏車運(yùn)送到鎮(zhèn)江麥德龍超市，全程冷鏈運(yùn)輸。從鎮(zhèn)江麥德龍超市購得12塊真空包裝的牛腱子肉，每塊牛腱子肉(800 g左右)切割出10個(gè)3 cm×3 cm×1 cm的肉塊，共計(jì)120個(gè)樣品。其中60個(gè)樣品作為冷鮮肉冷藏7 d后進(jìn)行試驗(yàn)，另外60個(gè)樣品經(jīng)真空包裝機(jī)獨(dú)立真空包裝后置于-18℃冰柜中冷凍7 d后取出，在4℃下解凍2 d后進(jìn)行試驗(yàn)。樣品一半用于理化試驗(yàn)，另一半用于質(zhì)構(gòu)測定和超聲圖像采集。為了使冷鮮和解凍牛肉更具有對比性，切割出的相鄰的兩塊牛肉其中一塊作為冷鮮肉，另一塊作為解凍肉進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)構(gòu)測定

采用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀(英國 SMS 公司)對樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測試，采用P/50型探頭，探頭垂直肌纖維方向進(jìn)行測定。測試條件：環(huán)境溫度20～25℃，測前速率5 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率5 mm/s，壓縮比35%，測定間隔時(shí)間5 s。質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果用TPA-macro程序分析。

1.2.2微觀結(jié)構(gòu)觀察

分別從冷鮮與解凍牛肉上取0.3 cm×0.3 cm×0.6 cm肉樣，放入4%多聚甲醛中4℃固定48 h，酒精脫水，石蠟包埋，切片厚約為5 μm，HE(蘇木精-伊紅染色法)常規(guī)染色，最后封片。使用DM6000B型顯微鏡進(jìn)行切片觀察。

1.2.3色差和蒸煮損失率測定

采用Hunterlab型分光測色儀，測定樣品的L*、a*和b*值(明度、紅度和黃度)。測試前先用標(biāo)準(zhǔn)白板和黑卡校正儀器。每個(gè)牛肉樣品在不同肌肉位置測定3次，取平均值。

取一定量的肉樣，用分析天平準(zhǔn)確稱量，記為m1，裝入蒸煮袋中密封，放入80℃的水浴鍋中加熱20 min后取出，冷卻后用吸水紙吸干肉塊表面水分，再次稱量，記為m2。

蒸煮損失率計(jì)算公式為

式中W——蒸煮損失率

m1——蒸煮前肉樣質(zhì)量

m2——蒸煮后肉樣質(zhì)量

1.2.4超聲圖像采集

通過實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的超聲顯微成像系統(tǒng)采集樣品的超聲圖像，系統(tǒng)示意圖如圖1所示。系統(tǒng)部件主要包括UTEX 320型超聲波激發(fā)/接收器(加拿大UTEX Scientific Instruments公司)，直徑10 mm、焦距25.4 mm的20 MHz點(diǎn)聚焦型超聲波換能器(日本Olympus Corporation公司)，高速A/D數(shù)據(jù)采集卡(美國Agilent Technologies公司)，三軸精密直線電機(jī)掃描機(jī)構(gòu)(珠海創(chuàng)峰精工機(jī)械有限公司)，計(jì)算機(jī)，樣品槽等。設(shè)定不同超聲圖像采集參數(shù)進(jìn)行多次試驗(yàn)并采用拉普拉斯梯度法評價(jià)不同參數(shù)下圖像清晰度，由此確定了牛肉超聲圖像采集的最佳參數(shù)。最佳參數(shù)為：脈沖電壓250 V；脈沖寬度25 ns；脈沖頻率800 Hz；增益55 dB；分辨率0.1 mm；掃描速度5 mm/s。所有樣品在相同的參數(shù)和環(huán)境下進(jìn)行超聲圖像采集。

圖1 超聲顯微成像系統(tǒng)Fig.1 Ultrasonic imaging system1.超聲波激發(fā)/接收器 2.數(shù)據(jù)采集卡 3.計(jì)算機(jī) 4.運(yùn)動(dòng)控制卡 5.主控電路 6.三軸移動(dòng)平臺(tái) 7.換能器 8.試樣 9.水平臺(tái)

1.2.5數(shù)據(jù)處理

紋理分析是超聲圖像分析的重要手段。紋理信息可以反映超聲回波信號分布情況，從而評價(jià)牛肉內(nèi)部結(jié)構(gòu)。灰度共生矩陣反映了圖像灰度級空間分布二階紋理信息。采用灰度共生矩陣法提取超聲圖像的紋理特征值，從0°、45°、90°和135°共4個(gè)方向計(jì)算灰度共生矩陣，提取各方向下的角二階矩(Angular second moment，ASM)、對比度(Contrast，CON)、相關(guān)性系數(shù)(Corrlation，COR)和逆差矩(Homogeneity，HOM)，并計(jì)算圖像的熵(Entropy，ENT)、各向異性系數(shù)(Anisotropy)、平均灰度(Average，AVG)和方差(Variance，VAR)，得到共計(jì)20個(gè)紋理特征變量。先通過主成分分析法(Principal component analysis，PCA)對所得紋理特征變量進(jìn)行降維，再分別建立線性判別分析(Linear discriminant analysis，LDA)模型和支持向量機(jī)(Support vector machine，SVM)模型，并比較識(shí)別效果。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，采用Matlab 7.0軟件提取超聲圖像紋理和建立判別模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果

質(zhì)地多面剖析法(Texture profile analysis，TPA)是質(zhì)構(gòu)儀利用探頭模擬人口腔的咀嚼運(yùn)動(dòng)，對樣品進(jìn)行兩次壓縮，用軟件輸出質(zhì)構(gòu)參數(shù)的方法[20]。通過表1可以看出，測得的冷鮮和解凍牛肉各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)參數(shù)有極顯著差異(P<0.01)。硬度是使食品達(dá)到一定形變所需要的力，反映了食品保持外形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)合力。解凍牛肉的硬度小于冷鮮牛肉的硬度，這是由于凍藏過程中肌細(xì)胞間自由水形成冰晶后，肌細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合水以之為晶核使冰晶生長，而在解凍時(shí)部分冰晶解凍后的水無法回到肌細(xì)胞內(nèi)，使得肉持水性變差，可溶性物質(zhì)減少，使得肉塊硬度減小。解凍牛肉的內(nèi)聚性小于冷鮮牛肉，說明解凍牛肉結(jié)構(gòu)的內(nèi)部鍵力小，口感較差。牛肉中水化層與蛋白質(zhì)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有抵抗外力的能力，表現(xiàn)為肉的回復(fù)性[18]。解凍牛肉比冷鮮牛肉回復(fù)性差，可能是由解凍肉系水力下降，蛋白質(zhì)變性所導(dǎo)致。質(zhì)構(gòu)結(jié)果綜合表明，經(jīng)冷凍解凍的牛肉內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，汁液流失嚴(yán)重，原本復(fù)雜有序的結(jié)構(gòu)趨向均勻。

表1 冷鮮與解凍牛肉質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果Tab.1 Results of texture indexes of fresh and frozen-thawed beef

2.2 微觀結(jié)構(gòu)

冷鮮牛肉與解凍牛肉的肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示，圖2a和圖2b分別是在光學(xué)顯微鏡下看到的冷鮮與解凍牛肉肌原纖維的石蠟切片圖。從圖中可以看出，冷鮮牛肉肌纖維結(jié)構(gòu)完整，肌纖維斷面呈圓形或多邊形，細(xì)胞周邊有較多的細(xì)胞核。肌纖維之間有一定間隙，這是因?yàn)檫M(jìn)口牛肉經(jīng)過一定時(shí)間的冷鮮儲(chǔ)存品質(zhì)略有下降。解凍牛肉肌肉組織的完整性被破壞，肌內(nèi)膜和肌束膜破裂，肌纖維邊界模糊，肌原纖維蛋白內(nèi)部的水遷移到膜外。由于肌纖維在牛肉冷凍時(shí)受到冰晶體擠壓出現(xiàn)裂口，解凍后細(xì)胞液流出，與組織液混合。

圖2 冷鮮與解凍牛肉微觀結(jié)構(gòu)圖像Fig.2 Microstructure diagrams of fresh and frozen-thawed beef

2.3 色差及蒸煮損失率測定結(jié)果

除了從質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和微觀結(jié)構(gòu)上可以看出肉內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的變化，肉樣的一些理化指標(biāo)也可以側(cè)面反映組織結(jié)構(gòu)變化情況。結(jié)合實(shí)際條件，選取L*、a*、b*和蒸煮損失率4個(gè)理化指標(biāo)來觀察分析。

肉色是評價(jià)肉類品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，它很大程度上影響了消費(fèi)者的購買欲望。從表2可以看出，冷鮮牛肉的L*極顯著高于解凍牛肉(P<0.01)，a*顯著高于解凍牛肉(P<0.05)，b*差異不顯著。L*表示肉樣的明度，明度越大說明肉樣越有光澤；a*表示肉樣的紅度，紅度越大說明肉樣顏色越鮮艷、品質(zhì)越好[21]。解凍牛肉由于蛋白質(zhì)變性保水性下降，水分滲出導(dǎo)致明度減小；由于肌肉組織中肌紅蛋白發(fā)生氧化導(dǎo)致紅度減小。

表2 冷鮮與解凍牛肉理化指標(biāo)測定結(jié)果Tab.2 Results of physical and chemical indexes of fresh and frozen-thawed beef

注：同一行不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同一行不同小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

蒸煮損失率可以反映肌肉的持水能力，其大小與肌肉蛋白的溶解性有關(guān)。冷鮮牛肉的蒸煮損失率極顯著低于解凍牛肉(P<0.01)。肉樣在凍融過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，膠體性質(zhì)被破壞，蒸煮損失增加，也表明肉樣持水性變差。

2.4 牛肉超聲圖像及紋理特征值

圖3為從冷鮮與解凍牛肉超聲圖像中各隨機(jī)抽取的一幅圖像。冷鮮牛肉圖像整體反射回波強(qiáng)度較大，解凍牛肉圖像整體反射回波強(qiáng)度較小；圖像均一性較差，部分區(qū)域反射回波與相鄰區(qū)域有較大差異。根據(jù)超聲成像原理，當(dāng)超聲波傳經(jīng)兩種聲阻抗不同的相鄰介質(zhì)的界面時(shí)會(huì)發(fā)生反射，通過傳感器收集處理反射回波在計(jì)算機(jī)上形成圖像。故反射回波強(qiáng)度表現(xiàn)了被測樣品內(nèi)部質(zhì)構(gòu)變化的程度，回波強(qiáng)度越大說明樣品內(nèi)部質(zhì)構(gòu)變化程度越大。根據(jù)2.1、2.2、2.3節(jié)的分析結(jié)果可知，冷鮮牛肉組織結(jié)構(gòu)較為完好，肌纖維邊界明顯，肌纖維與組織液組成了質(zhì)構(gòu)差異大的結(jié)構(gòu)，因此圖像整體反射回波較大；解凍牛肉組織遭到破壞，細(xì)胞液流出與組織液混合，肌纖維邊界模糊，且水分大量流失發(fā)生干縮，因而內(nèi)部質(zhì)構(gòu)差異減小，圖像整體反射回波較小。采集得到的牛肉超聲反射圖像均一性差，這是由于樣本中有未剔凈筋膜和血管存在，且生物組織樣本具有多樣性。表3為從超聲圖像中提取的部分紋理特征值，可以看出冷鮮與解凍牛肉紋理特征值差異極顯著(P<0.01)。其中，ASM、HOM、ENT、AVG差異最為顯著。ASM是圖像均勻性的度量，反映圖像灰度分布均勻的程度[22]。其值大說明紋理較為均一、變化規(guī)則。HOM反映圖像紋理的同質(zhì)性, 度量圖像紋理局部變化量[23]。其值大表明圖像紋理不同區(qū)域間變化小，局部比較均勻。ENT代表了圖像中紋理的非均勻程度或復(fù)雜程度。這些紋理特征值差異與所采集的超聲圖像差異相對應(yīng)。

圖3 冷鮮與解凍牛肉超聲圖像Fig.3 Ultrasound images of fresh and frozen-thawed beef

紋理特征值冷鮮牛肉解凍牛肉角二階矩ASM(0°)(2.35±0.59)×10-2(3.69±0.73)×10-2相關(guān)性系數(shù)COR(0°)0.9878±0.00390.9931±0.0041逆差矩HOM(0°)0.76±0.040.83±0.03對比度CON(0°)3.51±0.871.99±0.65角二階矩ASM(45°)(1.62±0.54)×10-2(2.72±0.63)×10-2逆差矩HOM(45°)0.64±0.040.71±0.03角二階矩ASM(90°)(2.39±0.64)×10-2(3.66±0.72)×10-2逆差矩HOM(90°)0.78±0.030.82±0.03角二階矩ASM(135°)(1.64±0.54)×10-2(2.76±0.63)×10-2逆差矩HOM(135°)0.64±0.050.71±0.04熵ENT5.07±0.174.66±0.23平均灰度AVG112.28±14.4796.02±12.69

注：表中數(shù)據(jù)是經(jīng)單因素方差分析篩選的具有極顯著差異(P<0.01)的紋理特征值。

2.5 主成分分析

主成分分析(PCA)是一種多元分析方法，可在不丟失主要信息的前提下，選擇較少的新變量來代替原來較多的變量[24]，可以達(dá)到數(shù)據(jù)降維的目的。圖4為冷鮮與解凍牛肉超聲圖像紋理特征值主成分分析的結(jié)果，前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.71%，基本能夠代表全部信息。從圖中可以看出冷鮮牛肉和解凍牛肉大致可以各自聚為一類，有小部分區(qū)域發(fā)生重疊，表明超聲成像技術(shù)結(jié)合PCA可以基本區(qū)分冷鮮與解凍牛肉。

圖4 三維PCA主成分得分圖Fig.4 Three-dimensional projection of PCA result

2.6 LDA鑒別模型

線性判別分析(LDA)也稱Fisher線性判別，是一種常用的模式識(shí)別方法，其基本思想是從高維特征空間中提取出最具辨別能力的低維特征，這些特征可以幫助同類樣本聚集在一起，不同類樣品盡量分離[25]。

對牛肉超聲圖像紋理特征值進(jìn)行主成分分析處理，隨機(jī)選取總樣本的2/3作為訓(xùn)練集，剩余1/3作為測試集，利用LDA進(jìn)行分析。選取不同的主成分?jǐn)?shù)作為模型的輸入，牛肉類別(冷鮮或解凍牛肉)為模型的輸出，建立LDA判別模型，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為5時(shí)，LDA模型的訓(xùn)練集和測試集識(shí)別率均達(dá)到100%，表明超聲成像技術(shù)結(jié)合LDA模型可以很好地鑒別冷鮮與解凍牛肉。

圖5 各主成分?jǐn)?shù)下LDA的識(shí)別率Fig.5 Identification rate of each principal component based on LDA

2.7 SVM鑒別模型

支持向量機(jī)(SVM)是一種以統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論和結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小原理為基礎(chǔ)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，它通過非線性映射將低維不可分樣本轉(zhuǎn)化到高維特征空間使其線性可分，較好地解決了小樣本、非線性、高維度、局部極小等問題[26-27]。選取徑向基函數(shù)作為內(nèi)積核函數(shù)，通過交叉驗(yàn)證(Cross validation，CV)尋找最佳參數(shù)(懲罰參數(shù)c和核函數(shù)參數(shù)γ)，選取不同的主成分?jǐn)?shù)作為模型的輸入。通過優(yōu)化得最佳主成分?jǐn)?shù)為4，最佳參數(shù)c=32，γ=0.125。識(shí)別率結(jié)果如圖6所示，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為4時(shí)，模型預(yù)測性能最佳，訓(xùn)練集識(shí)別率為95%，測試集識(shí)別率為90%。

圖6 各主成分?jǐn)?shù)下SVM的識(shí)別率Fig.6 Identification rate of each principal component based on SVM

3 結(jié)束語

分析了冷鮮與解凍牛肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)、微觀結(jié)構(gòu)和部分其他理化指標(biāo)差異，解釋了冷鮮與解凍牛肉超聲圖像差異，提取超聲圖像紋理特征值，建立了冷鮮與解凍牛肉鑒別模型。結(jié)果表明：冷鮮和解凍牛肉質(zhì)構(gòu)參數(shù)差異極顯著(P<0.01)，從質(zhì)構(gòu)參數(shù)、微觀圖像和部分其他理化指標(biāo)可以看出，解凍牛肉微觀結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞液滲出流失，肌細(xì)胞邊界模糊，內(nèi)部質(zhì)構(gòu)變化較小，致使超聲反射回波較小。冷鮮與解凍牛肉超聲圖像紋理特征值差異極顯著(P<0.01)，通過提取超聲圖像紋理特征值建立的識(shí)別模型中，LDA模型訓(xùn)練集和測試集識(shí)別率均達(dá)到100%，SVM模型訓(xùn)練集識(shí)別率為95%，測試集識(shí)別率為90%。LDA模型為線性模型，相對于SVM模型更加簡單，容易實(shí)現(xiàn)。因此，超聲成像技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以鑒別冷鮮與解凍牛肉，本研究可為超聲成像技術(shù)應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域提供新的思路。