CD80／CD86在Graves病動物模型中的表達及意義＊

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科（武漢）

葉 楓 馬曉丹△ 高 雷△ 徐 利△ 侯 鵬△ 吳曉燕△ 伍麗萍△ 施秉銀△

GD是B細胞介導、T細胞依賴的自身免疫性疾病，其發病機制主要是針對TSHR的自身抗體TSAbs模擬TSH作用，與TSH受體結合，引起甲狀腺腫大、甲狀腺激素釋放增加，最終引發臨床甲亢。而甲狀腺細胞合成的各種免疫相關因子維持甲狀腺內的自身免疫過程［1］。CD80／CD86主要表達于活化的APC細胞、巨噬細胞和B細胞，與配體CD28／CTLA-4結合，為T細胞活化提供第2信號；誘導T細胞向Th1／Th2分化；參與B細胞增殖活化的調節，在自身免疫性疾病的發生發展中起著重要作用［2］。本研究主要是通過Graves病動物模型探討CD80／CD86在各組織的表達及可能的意義。

材料與方法

1 重組腺病毒的構建 經連接、轉化、篩選得到的重組質粒pDC316-TSHR289，與重組腺病毒骨架質粒pBHGloxdel E13cre共轉染293細胞，出現噬斑后凍溶細胞3次，收集上清，經鑒定正確后接種293細胞進行大量擴增。

2 動物實驗 將23只6～8周齡SPF級雌性BALB／c小鼠隨機分為兩組：對照組（7只），甲亢組（16只）。飼養于西安交通大學醫學院動物實驗中心SPF級動物房，兩組小鼠分別于第1、21天經股四頭肌注射50μl包含有1×109顆粒的 Ad-Lacz（對照組）、Ad-TSHR289（甲亢組）的PBS誘導甲亢。所有小鼠于第2次免疫后兩周摘除眼球采血，脫臼處死。然后固定，剪毛，常規消毒頸部、腹部皮膚，顯微鏡下逐層剪開皮膚、肌肉組織，取一側甲狀腺置于2ml的無菌、無RNA酶的凍存管，放入液氮罐中保存，另一側甲狀腺置于4%多聚甲醛中固定，用于組織學觀察。打開胸腔、腹腔，取心臟、胸腺、脾臟、肝臟置于2ml的無菌、無RNA酶的凍存管，放入液氮罐中保存。

3 小鼠血清TRAb、TT4測定 以放射免疫法進行測定。

4 甲狀腺組織病理學檢查 小鼠處死后，分離甲狀腺，4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。

5 實時定量PCR實驗 提取總RNA，逆轉錄為cDNA，取八連管，做好標記，加入反應體系：蒸餾水6μl，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μl，引物2μl（CD80上游引物：GGCAAGGCAGCAATACCTTA，下 游 引 物：CTCTTTGTGCTGCTGATTCG；CD86上游引物：TCTCCACGGAAACAGCATCT，下游 引 物：CTTACGGAAGCACCCATGAT），cDNA 2μl總量20μl；反應條件：PCR擴增條件為：預變性95℃10s，變性95℃5s，復性55℃15s，延伸72℃15s，40個循環?；虮磉_量通過計算2-△△（Ct）得出結果。在進行實時定量PCR反應時，均設置陰性對照（即不含任何cDNA模板，但具有所有反應試劑的PCR反應體系）。瓊脂糖凝膠電泳進行參物鑒定。

6 CD86免疫組化及評分標準

6．1 免疫組化 甲狀腺組織標本經脫蠟、水化、抗原修復、3%過氧化氫室溫15min消除內源性過氧化物酶；山羊血清37℃封閉20min后，滴加一抗（1∶200稀釋）。4℃冰箱過夜。過夜后復溫40min至1h。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；滴加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察、分析。

6．2 評分標準 每個組織塊評分由兩部分組成：總分＝陽性面積＋強度。陽性面積評分標準：0分，陽性濾泡個數／總濾泡個數＜25%；1分，25%≤陽性濾泡個數／總濾泡個數＜50%；2分，50%≤陽性濾泡個數／總濾泡個數＜75%；3分，陽性濾泡個數／總濾泡個數≥75%。強度評分標準（選擇陽性率最高的濾泡）：0分，陽性濾泡上皮細胞個數／總濾泡上皮細胞個數＜25%；1分，25%≤陽性濾泡上皮細胞個數／總濾泡上皮細胞個數＜50%；2分，50%陽性濾泡上皮細胞個數／總濾泡上皮細胞個數＜75%；3分，陽性濾泡上皮細胞個數／總濾泡上皮細胞個數≥75%。總分：0～1，低表達或不表達；2～4，較強表達；5～6強表達。

7 統計學處理 本組應用SPSS13．0統計軟件包，組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

1 血清T4結果 以對照組小鼠血清T4的作為正常上下限（24．92～104．9ng／ml），超過正常上限視為甲亢（見圖1）。

圖1 對照組（Ad-LacZ）和造模組（Ad-TSHR289）小鼠血清T4水平 陰影部分代表對照組小鼠血清T4的，血清T4水平高于上限的小鼠視為甲亢鼠（甲亢組）

2 CD80／CD86在甲狀腺組織中的表達 既往的研究由于受到藥物干預以及環境因素等的影響，關于CD80／CD86在甲狀腺組織的表達尚無統一結論，我們首先檢測了CD80／CD86在甲狀腺組織mRNA水平的表達（見圖2A），我們發現：CD86mRNA水平表達在造模組以及甲亢組均明顯增高（P＜0．05），而CD80mRNA水平的表達在各組間無顯著性差異（P＞0．05）。造模組及對照組均有4只小鼠低表達或不表達CD86；造模組有9只小鼠而對照組僅有3只小鼠較強表達CD86；造模組有3只小鼠高表達CD86（見圖2B）。造模組CD86的表達相對于對照組明顯升高（P＜0．05），甲狀腺濾泡上皮細胞CD86也有較強表達（見圖2C）。

圖2 對照組、造模組和甲亢組小鼠甲狀腺組織CD80／CD86mRNA以及蛋白水平的表達 陽性染色如箭頭所示：a～c為CD86（×400）；a，低表達；b，較強表達；c，強表達

3 CD80／CD86在其它組織中的表達 見圖3。與對照組相比，造模組及甲亢組CD86在肝臟組織的表達明顯增高（P＜0．05），而在心臟組織、胸腺組織、脾臟組織的表達無明顯差異（P＞0．05），CD80在各組織的表達無顯著性差異（P＞0．05）。

圖3 對照組、造模組和甲亢組小鼠不同組織CD80／CD86 mRNA水平的表達

討 論

B7是分子量為44～54KDa的I型跨膜糖蛋白，屬于丁酰苯受體家族，目前研究較多的是CD80和CD86。CD80、CD86主要表達于活化的APC細胞、巨噬細胞和B細胞，兩者結構上都有IgV和IgC區，具有25%的同源序列，配體均為CD28／CTLA-4，且都通過與配體結合為T細胞活化提供第二信號，但兩者無論是在結構上還是功能上均存在一些區別［3，4］。①相對于CD86，CD80與配體的結合能力較強，它與CTLA-4、CD28結合的平衡解離常數（Kd）分別為0．2μM、4μM，而CD86大約弱5～10倍，其 Kd值分別為2．6μM、20μM；②兩者與配體結合的傾向性不一樣，CD80主要與CTLA-4結合，下調T細胞自身免疫反應，在同種異體移植誘導免疫耐受中起著重要作用，而CD86更傾向與CD28結合，介導T細胞活化；③表達時間不一致，雖然CD80與CTLA-4不是組成性地表達，但都是在細胞活化后若干天上調，CD80可穩定表達4～5d，而CD86與CD28組成性地表達，在APC活化后迅速上調，48h達高峰；④ Th1／Th2分化，CD80和CD86參與誘導T細胞向Th1／Th2分化，CD80更傾向于誘導T細胞向Th1分化，而CD86促進IL-4的產生，誘導T細胞向Th2分化，抑制體內CD80表達會加重自身免疫反應，而抑制體內CD86表達會減弱自身免疫反應。例如：在1型糖尿病小鼠體內注射抗CD80抗體可加重病情發展，而注射抗CD86抗體可阻止該病的發生。⑤介導B細胞作用，CD80、CD86在介導B細胞信號傳導中扮演著不同的角色。CD86促進B細胞增殖活化，增加IgG1、IgG2a以及IgE的產生，上調抗-凋亡分子的表達，而CD80作用相反。因此，盡管CD80和CD86分子結構同源，而且有著共同的配體，但兩者在免疫反應中的作用不同，導致T和B細胞向不同的方向發展。

B7-CD28／CTLA-4體內的雙向調節作用，決定了其在自身免疫性疾病中的重要性。大量研究發現：B7-CD28／CTLA-4共刺激因子功能異常在自身免疫性疾病的發生、發展以及病生機制中起著重要作用。在自身免疫性疾病，如：MS、RA、銀屑病以及SLE等患者體內均發現CD80或CD86的高表達，本研究發現：Ad-TSHR289干預組小鼠甲狀腺組織CD86的表達相對于對照組明顯增高。CD86是體內重要的共刺激因子，高表達于活化的T細胞、樹突狀細胞，在自身免疫性疾病的早期階段起著重要作用，CD86的高表達可能參與了甲亢的發病機制。因此，我們對比了甲亢鼠與對照鼠甲狀腺組織CD86的表達，我們發現甲亢鼠甲狀腺組織CD86表達明顯增高，并且血清T4水平與甲狀腺組織CD86的表達有正相關趨勢，這進一步表明：CD86在甲亢發病機制中的重要性。值得注意的是：在我們的研究中，我們僅發現CD86明顯增高，并未發現CD80的增高，這可能與它們在介導輔助性T細胞向Th1和Th2分化中起著不同的作用有關。Th1和Th2型輔助性T細胞之間的平衡破壞是GD發病機制中一個很重要的因素。以前也有研究發現甲亢患者體內CD86明顯增高并認為CD86在促使甲狀腺組織輔助性T細胞向Th2分化中起著重要作用［5］，但關于甲亢到底是Th1還是Th2介導為主的疾病的爭論由來已久，我們的研究在一定程度上更支持甲亢是Th2介導為主的自身免疫性疾病。另外，Marek［6］等通過體內外研究發現：T3以及L-T4可增加CD86＋DCs細胞比例，而對CD80＋DCs細胞無影響，進一步表明CD86而不是CD80與GD密切相關。

既往研究發現：CD86在急性肝功能衰竭的肝臟組織的多種細胞中的表達明顯升高，而且CD86在大面積肝壞死以及肝臟炎性侵潤之前就增高了，意味著它們在肝組織損傷前就已經起到了重要的作用，是肝損傷的潛在危險因素［7］。本研究也發現：甲亢組小鼠肝臟組織的CD86表達相對于對照組明顯增高。因此我們認為：甲亢組小鼠肝臟組織的CD86的明顯增高可能是甲亢肝損的潛在危險因素，當然這還需要后續實驗進一步證實。

總之，我們的研究發現造模組和甲亢組小鼠甲狀腺組織高表達CD86，認為CD86可能參與了GD的發病機制。同時肝臟組織的CD86的上調可能是甲亢引起肝臟損傷的潛在危險因素。

［1］ Brent GA．Graves＇disease［J］．New England Journal of Medicine，2008，359（13）：2594-2605．

［2］ Podojil J R，Miller SD．Targeting the B7family of costimulatory molecules：successes and challenges［J］．Bio Drugs，2013，27（1）：1-13．

［3］ Bhatia S，Edidin M，Almo SC，etal．B7-1 and B7-2：similar costimulatory ligands with different biochemical［J］．oligomeric and signaling properties，Immunology Letters，2006，104（1）：70-75．

［4］ Lim TS，Goh JK，Mortellaro A，etal．CD80and CD86differentially regulate mechanical interactions of T-cells with antigen-presenting dendritic cells and B-cells［J］．P Los One，7（9）：1-8．

［5］ Inukai Y，Momobayashi A，Sugawara N，etal．Changes in expression of T-helper（Th）1-and Th2-associated chemokine receptors on peripheral blood lymphocytes and plasma concentrations of their ligands，interferon-inducible protein-10 and thymus and activation-regulated chemokine，after antithyroid drug administration in hyperthyroid patients with Graves＇disease［J］．European Journal of Endocrinology，2007，156（6）：623-630．

［6］ Dedecjus M，Stasiolek M，Brzezinski J，etal．Thyroid hormones influence human dendritic cells＇phenotype function，and subsets distribution［J］．Thyroid，2011，21（5）：533-540．

［7］ Leifeld L，Trautwein C，Dumoulin FL，etal．Enhanced expression of CD80（B7-1），CD86（B7-2），and CD40and their ligands CD28and CD154in fulminant hepatic failure［J］．American Journal of Pathology ，154（6）：1711-1720．