電感耦合等離子體質譜測定尿銅不確定度評定

湯燕燕 陳金發

銅是人體必需元素，血液中的銅大約有40%與組氨酸或清蛋白結合，其余均與銅藍蛋白結合[1]。臨床上，尿銅作為診斷肝豆狀核變性的重要參考指標，越來越多被應用于研究[2-5]。檢測領域普遍認為完整的測量結果應包括測量不確定度。醫學實驗室測量不確定評定方法主要有“自上而下法”和“自下而上法”，前者被廣泛應用于醫學實驗室測量不確定度評定[6-8]。當“自上而下法”評定的測量不確定度達不到目標不確定度時，可用“自下而上法”識別不確定度的各種來源，通過改進產生主要影響因素的實驗過程，從而降低項目的測量不確定度。目前在衛生相關領域，自下而上法評定不確定度的文章已有報道[9-10]。文章依據《測量不確定度評定和表示》[11]、《生物樣本測量不確定度評定與表示應用指南》[12]，采用自下而上法對電感耦合等離子體質譜測定尿銅的過程產生的不確定度進行評定，為改進測量過程、降低測量不確定度提供一定的參考價值。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

渦旋振蕩器為廣州儀科實驗室技術有限公司生產，型號為MS3 basic S25；微控數顯電熱板為萊伯泰科有限公司生產，型號為EH45A Plus；電子天平為英國艾德姆公司生產，型號為PWC184；電感耦合等離子體質譜儀為美國PerkinElmer公司生產，型號為NexION 350X；一體化超純水系統為美國Merck MILLIPORE公司生產，型號為ELIX Essential＋SynergyUV；多元素混合標準溶液由美國PerkinElmer公司生產；優級純濃硝酸為國藥集團化學試劑有限公司生產；整個實驗過程所有用水均由一體化超純水系統制得。

1.2 實驗步驟

尿樣來自健康體檢的成人尿液，并按下述步驟對尿樣進行前處理：首先使用振蕩器對尿樣進行均勻振蕩，然后取30 mL的PFA溶樣罐，先后加入2.5 mL移液管吸取的尿及5 mL優級純濃硝酸，輕加蓋，置于微控數顯電熱板，保持在80 ℃半小時后，將瓶蓋旋緊，待溫度上升至120 ℃后不再升溫，繼續消解至透明澄清。接著設置溫度為80 ℃，開蓋趕酸直至溶液剩余體積小于1 mL，隨后自然冷卻至室溫，用超純水作為溶劑定量至50 g，以0.22 μm濾膜過濾，用電感耦合等離子體質譜儀采用外標法對定容后的消解試液進行測量。空白試驗、平行試驗以及加標試驗按上述相同步驟同時進行。

1.3 系列標準工作溶液配制

用移液器準確移取含銅濃度為100 μg/mL的多元素混合標準儲備溶液10 μL,加入到EP管中，加入990 μL超純水，用渦旋振蕩器混合均勻，得到含銅濃度為1 μg/mL的多元素混合工作溶液。各濃度標準工作溶液的配制步驟為用適當量程的移液器分別移取對應體積含銅濃度為1 μg/mL的多元素混合工作溶液，以超純水作為溶劑，在天平上定量至10 g，渦旋振蕩器混勻。配制濃度、使用移液器量程和移取體積見于表1。

2 結果

2.1 項目不確定度的來源分析評定

2.1.1 建立數學模型

式中：X為尿樣中銅元素含量（單位：ng/mL）；ci為消解試樣溶液扣除空白對照后銅的質量濃度（單位：ng/g）；M為消解液的定容質量（單位：g）；v為試驗尿樣體積（單位：mL）；frep為重復測量的影響因子。

2.1.2 項目各不確定度分量評定

根據上述構建的數學模型，尿樣中銅元素含量測定的不確定度來源包括尿樣體積移取產生的不確定度u（v）；消解試液中銅元素濃度測定過程產生的不確定度u（c）；電子天平定量消解液產生的不確定度u（M）；重復多次測量所產生的不確定度u（rep）。

2.2 項目各不確定度分量計算

2.2.1 試驗尿樣體積移取產生的不確定度u（v）

2.2.2 消解試液中銅元素濃度測定過程產生的不確定度u（c）

表1 各濃度標準工作溶液配制過程移液器產生的不確定度

表2 銅元素重復測定結果

表3 各不確定度分量的相對不確定度

2.2.2.4 系列標準工作溶液線性擬合產生的不確定度u4（c）采用質量濃度不同的5個標準溶液進行線性擬合，每個濃度的標準溶液測1次，分別得到對應的響應值。為得到銅元素的標準工作曲線，以銅元素的質量濃度為橫坐標，每個濃度對應測得的響應值為縱坐標，采用最小二乘法進行擬合，得到線性方程為：y=512.7x-233.54,該擬合曲線的線性相關系數R2大于0.999 6。3個平行消解試液測得的響應值（扣除空白對照后）分別為y1=4 089.7，y2=4 112.7，y3=4 084.8，代入方程計算得到3個消解液的濃度分別為，8.43 ng/g，8.48 ng/g，8.32 ng/g，平均值

其標準不確定度按如下公式計算：

式中：s為標準工作曲線回歸偏差；a為擬合曲線的斜率；；P為平行測量的次數（本實驗P=3）；N為擬合曲線數據點數（本實驗N=5）；c0為消解液的質量濃度；為擬合曲線系列標準溶液中銅元素的平均質量濃度；ci為擬合曲線第 個標準溶液的濃度；yi為第i個標準溶液測得的響應值； b為擬合曲線的截距。

2.2.4 重復多次測量所產生的不確定度u（rep） 在相同條件下對試液中的銅元素濃度進行7次測量，數據結果如表2。

2.3 項目不確定度分量的合成

2.4 擴展不確定度及結果

3 討論

文章利用電感耦合等離子體質譜，采用外標法，測定了人尿液中的銅元素的含量。同時采用自下而上的不確定度評定方法，對該測量過程的不確定度來源進行了分析，并計算了模型下各個不確定度分量和合成不確定度。從表3可以看出，在所建立的數學模型中，合成不確定度的影響因素依次為消解試液中銅元素濃度測定過程產生的不確定度、重復多次測量所產生的不確定度、試驗尿樣體積移取產生的不確定度、電子天平定量消解液產生的不確定度。試樣中銅元素濃度的不確定度主要由標準儲備液本身、標準儲備液稀釋過程、系列標準溶液配制過程、系列標準工作溶液曲線線性擬合過程產生的。它們產生的影響大小依次為系列標準工作溶液配制過程、多元素混合標準儲備液稀釋過程、系列標準溶液線性擬合過程、標準儲備液本身。從文中可以發現，采用天平作為定容質量工具，產生的不確定度較小，而移液器產生的不確定度較大。因此采用天平定量可提高實驗效率；同時，實驗過程中應選用合適量程規格的移液器，且所使用的移液器應該定時檢定計量。本實驗同時表明了擬合曲線的各標準點濃度選擇會影響不確定度，應盡可能讓測量點落在線性的中間位置，儀器的靈敏度也會影響不確定度，應對儀器做好期間核查，以確保靈敏度在正常范圍內。

綜上所述，采用電感耦合等離子體質譜測定尿中銅元素含量的過程中，要使用純度足夠的標準試劑，選擇檢定合格且量程適合的量器具，并設計合理的工作曲線范圍，同時對所涉及的儀器、試劑、環境質量進行嚴格管控，從而減小測量的不確定度，確保實驗的準確性。通過對測量過程進行不確定度評定和分析，可以讓實驗者更好的把握和控制實驗的每個環節，提高實驗效率，降低實驗誤差。