大孔樹脂純化桑葚渣中α-淀粉酶抑制劑的工藝優化及其活性成分研究

范 銘，向 露，徐文慧，曹 艷，劉 哲，陸勝民，，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農業科學院 食品科學研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，農業農村部果品采后處理重點實驗室，浙江 杭州 310021)

糖尿病是一種因胰島素分泌不足或胰島素作用障礙而引起的代謝疾病，其最主要特征是碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝紊亂，導致機體長期處于高血糖狀態[1]。近幾年，全世界的糖尿病發病率呈現持續上升趨勢，糖尿病現已成為世界第3大嚴重威脅人類健康的非傳染病[2-3]。糖尿病分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90%以上。對于Ⅱ型糖尿病患者，餐后高血糖的危害遠遠超過空腹高血糖，通過使用α-淀粉酶抑制劑來降低餐后血糖是治療Ⅱ型糖尿病的重要手段；因此，研究開發α-淀粉酶抑制劑已成為近年來藥物研究的熱點[4-5]。

α-淀粉酶抑制劑屬于糖(苷)水解酶抑制劑中的一種，它能有效地抑制腸道內唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂含量。因此，α-淀粉酶抑制劑可以作為防治肥胖癥、脂肪過多癥、動脈硬化癥、高血脂及糖尿病等的有效藥物。

桑葚屬于桑科，被列入藥食同源名錄，鮮果味道甜美、多汁，且營養豐富。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增強免疫、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等方面有顯著作用[6-7]。目前以桑葚為原料的產品，大多以酒、飲料之類的形式生產，榨汁后的桑葚渣則被丟棄，這樣既污染環境又浪費資源。據文獻報道，桑葚渣具有降血糖的功效[8]。本文以去離子水超聲輔助提取桑葚渣中α-淀粉酶抑制劑，對其分離純化方法進行優化，并研究其成分，旨在為探明桑葚中的降糖成分、開發降糖食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑葚品種為大十，采摘于浙江省安吉縣梅溪鎮馬村桑葚基地。

主要儀器設備：DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；BJ-300多功能粉碎機，德清拜杰電器有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，沃特世科技(上海)有限公司；BSA1245-CW電子天平(精確至0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ-500DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機，上海安亭科學儀器廠；RE-52A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；UV-1800紫外分光光度計，日本島津公司；層析柱，上海夏美生物科技有限公司。

主要試劑：可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉，購于上海國藥集團；二甲基亞砜，購于上海凌峰化學試劑有限公司；α-淀粉酶(豬胰腺淀粉酶)，購于Sigma公司；阿卡波糖、槲皮苷、異槲皮素、金絲桃苷，均為分析純標準品(純度均≥98%)，購于上海源葉生物科技有限公司；樹脂AB-8、S-8、D101、NKA-9和HZ-806，均購于鄭州勤實科技有限公司。

1.2 桑葚渣中降糖物質提取

稱取熱風干燥后的桑葚渣粉5 g，按1∶10的料液質量比加入去離子水，充分混勻后，在超聲溫度為60 ℃、超聲功率為500 W的條件下超聲提取1 h。超聲提取結束后，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得桑葚渣提取原液。將提取原液在50 ℃條件下減壓濃縮至一定體積，然后在阱溫度-40 ℃左右、真空度0.025 MPa條件下冷凍干燥72 h，之后用蒸餾水配成一定的濃度。體外測定提取液對α-淀粉酶活性的抑制率，作為反映提取液降糖效果的指標。

1.3 大孔樹脂型號篩選

本試驗選用的大孔樹脂有AB-8、S-8、D101、NKA-9、HZ-806，它們的型號及物理性質如表1所示。以對α-淀粉酶活性的抑制率為指標，考查各樹脂對提取液中降糖物質的分離效果。大孔樹脂在使用前需經過預處理，具體操作步驟見參考文獻[9]。稱取5 g已活化的濕大孔樹脂放入同一規格的錐形瓶中，量取25 mg·mL-1的桑葚粗提液20 mL于三角瓶中，放入搖床，25 ℃振蕩6 h，過濾，取濾液，測定其對α-淀粉酶活性的抑制率。水洗濾出的飽和樹脂除去其表面的殘留溶液，吸干表面水分，精確加入70%(體積分數)乙醇溶液20 mL振蕩6 h，濾出解吸液，濃縮后凍干，測定吸附前后的α-淀粉酶抑制活性，根據活性物質吸附及解吸率選擇出適宜的大孔樹脂。

表1 供試樹脂的物理參數

Table 1 Physical parameters of resins

樹脂Resin極性Polarity粒徑Particle size/mm比表面積Specific surface area/(m2·g-1)外觀色澤AppearanceD101非極性Nonpolarity0.30～1.25550乳白色或淺黃色Milky or light yellowAB-8弱極性Weak polarity0.30～1.25480乳白色或淺黃色Milky or light yellowHZ-806中極性Middle polarity 0.315～1.25—乳白色至淡藍色Milky to light blueS-8極性Polarity0.315～1.25100～120乳白色MilkyNKA-9極性Polarity0.30～1.25250～290乳白色Milky

1.4 大孔樹脂吸附體系優化

將預處理好的選定的大孔樹脂用濕法裝入內徑2.4 cm、體積700 mL的層析柱中，加入一定體積的桑葚渣水提液，選定上樣流速，靜置一段時間，測定流出液對α-淀粉酶的抑制率，確定吸附效果。之后以一定體積的去離子水沖洗柱子，將糖類等雜質沖出，隨即用乙醇溶液進行洗脫，將流出液濃縮、凍干，測定其對α-淀粉酶活性的抑制率。

1.4.1 上樣流速的選擇

將大孔樹脂填裝入內徑為2.4 cm的層析柱中，將一定體積的桑葚渣水提液按12、24、36、48 mL·min-1的速度經過層析柱，將流出液分別濃縮、凍干，測定其對α-淀粉酶活性的抑制率，從而得到最適上樣流速。

1.4.2 洗脫劑體積分數的選擇

將一定體積的桑葚渣水提液以一定流速上柱，靜置一段時間后，用水洗脫，再依次用相同體積的體積分數分別為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫，將各洗脫液濃縮、凍干，測定其對α-淀粉酶活性的抑制率，從而得到最適洗脫劑體積分數。

1.4.3 洗脫劑流速的選擇

一般來說，選擇合適的洗脫速度可以達到洗脫較完全且耗時較短的效果[10]。填充大孔樹脂后，加入一定體積的桑葚渣水提液，待其全部進入層析柱后將閥門關上，吸附一定時間，將吸附好的樹脂用70%(體積分數)乙醇分別以12、24、36、48 mL·min-1的流速進行洗脫，收集洗脫液，測定其對α-淀粉酶活性的抑制率，從而得到最佳洗脫流速。

1.5 α-淀粉酶活性抑制體系

取50 μL α-淀粉酶(2 U·mL-1)和一定濃度的抑制劑25 μL，在37 ℃孵化10 min，加入0.75%(質量分數)可溶性淀粉溶液1 mL，37 ℃反應5 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻后用蒸餾水稀釋2.5倍，在540 nm波長處測定吸光值[11-12]。如上分別構建空白管、空白對照管、抑制劑管和背景對照管的反應體系，其中：空白管中不加抑制劑，空白對照管不加α-淀粉酶和抑制劑，背景對照管不加α-淀粉酶。設空白管、空白對照管、抑制劑管和背景對照管在540 nm處測得的吸光值分別用A、B、C、D表示，則該抑制劑對α-淀粉酶活性的抑制率(I)為

(1)

1.6 洗脫液的液相檢測

1.6.1 供試品和對照品制備

在最佳吸附條件下，用不同體積分數(10%、30%、50%、70%、90%)的乙醇溶液或去離子水進行洗脫，收集洗脫液，經冷凍干燥，得到樣品，用色譜級甲醇進行溶解，統一配置成25 mg·mL-1的質量濃度，經過0.45 μm膜過濾器過濾，取濾液作為供試品溶液。

將槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷準確配制成質量濃度為4、6、8、10、25、30 mg·mL-1的色譜級甲醇溶液，經過0.45 μm膜過濾器過濾，取濾液作為對照樣品溶液[13]。

1.6.2 色譜條件

采用Sunfire C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為甲醇-水-冰醋酸(體積比5∶95∶0.1)溶液，流動相B為甲醇-冰醋酸(體積比100∶0.1)溶液。洗脫梯度見表2，流速1 mL·min-1，檢測波長360 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL[14]。

1.7 數據處理與分析

所有試驗重復3次。試驗數據采用Excel 2010軟件進行整理，在SPSS 17.0軟件平臺上進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇

經測定，在經過大孔樹脂吸附、解吸前，制備的桑葚渣水提液對α-淀粉酶活性的抑制率為(62.52±0.67)%，由于不同樹脂的靜態吸附-解吸性能相差較大，經大孔樹脂吸附和解吸后，其流出液對α-淀粉酶活性的抑制率呈現出較大區別(表3)。樹脂吸附后流出液對α-淀粉酶活性的抑制率越高，說明樹脂吸附效果越差。由此可知，在吸附性能方面，AB-8效果最好，HZ-806次之，D101效果最差。解吸后流出液對α-淀粉酶活性的抑制率越大，說明樹脂解吸效果好。由此可知，在解吸性能方面，同樣以AB-8的效果最好。綜上，AB-8樹脂對桑葚渣水提液中α-淀粉酶抑制劑的吸附、解吸效果均較好[15]，適用于桑葚渣中α-淀粉酶抑制劑的分離純化。

2.2 上樣流速的選擇

經測定，上樣前樣品對α-淀粉酶活性的抑制率為(58.16±0.22)%。采用不同的上樣流速進行吸附后，流出液對α-淀粉酶的抑制率如表4所示。可以看出，隨著上樣流速增大，樹脂吸附后流出液對α-淀粉酶的抑制率不斷升高，說明在本試驗條件下，增加上樣流速不利于樹脂吸附桑葚渣提取液中的α-淀粉酶抑制劑。一般情況下，物料流過樹脂的速度越慢，越有利于樹脂的吸附，吸附效果越優良；但是速率過慢，會導致吸附效率不高[16]，不利于生產投入。綜合考慮樹脂的吸附效果及工作效益，確定上樣流速為12 mL·min-1。

表2 洗脫梯度

Table 2 Elution gradient

t/minA/%B/%0100051000305050403070452080490100511000

表3 不同大孔樹脂對桑葚渣水提液中α-淀粉酶抑制劑的靜態吸附和解吸性能

Table 3 Adsorption-desorption capacity of 5 types of macroporous resins on alpha-amylase inhibitor of from mulberry pomace extracts

樹脂類型Resintype吸附后流出液的α-淀粉酶活性抑制率 Inhibitionrate of α-amylase activity ineffluent after adsorp-tion/%解吸后流出液的α-淀粉酶活性抑制率 Inhibitionrate of α-amylase activity ineffluent after desorption/%AB-80.74±0.2186.36±3.53S-840.13±2.6718.63±4.25NKA-922.70±3.3352.72±4.31HZ-80620.29±1.7448.66±2.97D10171.12±2.897.63±1.62

表4 不同上樣流速下流出液對α-淀粉酶活性的抑制率

Table 4 Inhibition rate of α-amylase activity by effluent under different sampling rates

流速Current speed/(mL·min-1)α-淀粉酶活性抑制率 Inhibitoryrate of α-amylase activity/%126.41±1.832416.74±2.813625.66±3.644826.12±2.19

2.3 洗脫劑體積分數的選擇

由圖1可知，洗脫液體積分數顯著(P<0.05)影響洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制效果。當乙醇的體積分數為0～30%時，隨著乙醇體積分數增加，流出液對α-淀粉酶活性的抑制率顯著(P<0.05)降低，說明洗脫劑的解吸效果減弱；當乙醇的體積分數為30%～70%時，隨著乙醇體積分數增加，洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率顯著(P<0.05)增加，說明洗脫劑的解吸效果增強；但當乙醇的體積分數進一步由70%增加至90%時，洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率顯著(P<0.05)下降。由于所選定的樹脂為弱極性，根據相似相溶原理，α-淀粉酶抑制劑易被極性較弱的乙醇洗脫下來，但乙醇體積分數過高則會使醇溶性雜質增多，導致解吸效果差。綜合試驗結果，確定最適洗脫劑為體積分數70%的乙醇。

2.4 洗脫劑流速的選擇

由圖2可知，隨著洗脫劑流速增加，洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率先增加后下降，說明洗脫速度過快并不利于物質解吸。當流速為24 mL·min-1時，洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率最高，且顯著(P<0.05)高于其他處理，因此選擇24 mL·min-1作為最適洗脫劑流速。

2.5 洗脫液的液相色譜分析結果

以前述選擇的最佳上樣速度，將吸附好的樹脂以不同體積分數的乙醇溶液(10%、30%、50%、70%、90%)和去離子水按最佳的洗脫速度進行洗脫，收集各洗脫液，濃縮、冷凍干燥，分別配制成統一質量濃度的洗脫液。其中，70%乙醇洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率為86.13%，其半抑制質量濃度(IC50)為(8.16±0.26)mg·mL-1，阿卡波糖和標準品槲皮苷對α-淀粉酶活性的IC50分別為(1.04±0.06)、(3.39±0.56)mg·mL-1。各洗脫液的液相色譜檢測結果如圖3所示。

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Barks marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 洗脫劑體積分數對洗脫液α-淀粉酶活性抑制效果的影響Fig.1 Effect of desorption solution concentration on α-amylase activity inhibitory rate of eluent

圖2 洗脫劑流速對洗脫液α-淀粉酶活性抑制效果的影響Fig.2 Effect of desorption rate on α-amylase activity inhibitory rate of eluent

由圖3可以看出，去離子水、10%乙醇洗脫液中成分較少，可能只有多糖被洗出[17]。體積分數為50%～90%的乙醇洗脫液中出現異槲皮苷和槲皮苷。異槲皮苷含量在50%乙醇洗脫液中最高，隨乙醇體積分數升高，乙醇洗脫液中異槲皮苷的含量逐漸減少，其質量濃度分別為26.08、24.33、15.03 mg·mL-1。槲皮苷在體積分數為50%、70%、90%的乙醇洗脫液中的質量濃度為分別為4.17、7.06、3.92 mg·mL-1。金絲桃苷在各洗脫液中均未出現。前述試驗結果顯示，50%、70%、90%乙醇洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率分別為40.42%、79.93%、35.71%，與槲皮苷在洗脫液中的質量濃度變化規律一致；另據文獻報道，槲皮苷具有降血糖的功效[18]。由此推測，槲皮苷可能是桑葚渣提取液中α-淀粉酶抑制劑的主要貢獻因子。

3 小結與討論

通過對比5種大孔樹脂對桑葚渣提取液中α-淀粉酶抑制劑的吸附-解吸情況，確定AB-8為最適用的大孔樹脂。在分離純化桑葚渣水提液中α-淀粉酶抑制劑時，其動態吸附和解吸的最佳工藝參數如下：上樣流速12 mL·min-1，洗脫劑為70%(體積分數)乙醇溶液，洗脫流速24 mL·min-1。在最佳吸附和解吸條件下，對不同體積分數乙醇洗脫液中的成分進行分析，發現洗脫液中槲皮苷的質量濃度與洗脫液對α-淀粉酶活性的抑制率呈現相似規律，推測槲皮苷可能是桑葚渣水提物中α-淀粉酶抑制活性的主要貢獻因子。

據測定，阿卡波糖、70%乙醇洗脫液、標準品槲皮苷對α-淀粉酶活性的IC50分別為(1.04±0.06)、(8.16±0.26)、(3.39±0.56)mg·mL-1。單就對α-淀粉酶活性的抑制效果而言，阿卡波糖最優，其次為槲皮苷標準品，洗脫液效果最差。這可能是由于洗脫液中還含有其他雜質，導致其對α-淀粉酶活性的抑制率降低。目前，有關植物中槲皮苷降血糖功效的文獻甚少。本研究結果可為從植物中提取α-淀粉酶抑制劑等相關研究提供參考，也為探索桑葚渣的資源化利用提供了新的思考方向。

A，去離子水洗脫液；B，10%乙醇洗脫液；C，30%乙醇洗脫液；D，50%乙醇洗脫液；E，70%乙醇洗脫液；F，90%乙醇洗脫液；G，標準品。A， Deionized water eluent; B， 10% ethanol eluent; C， 30% ethanol eluent; D， 50% ethanol eluent; E， 70% ethanol eluent; F， 90% ethanol eluent; G， Standard materials.圖3 各洗脫液的液相色譜成分分析Fig.3 High performance liquid chromatography analysis on compositions of eluents