一株鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯降解菌的篩選鑒定與降解特性

梁浩花，陶 紅，王亞娟，李嬌玲

(1.寧夏大學 資源環境學院，寧夏 銀川750021； 2.寧夏(中阿)旱區資源評價與環境調控重點實驗室，寧夏 銀川 750021； 3.寧夏大學 經濟管理學院，寧夏 銀川 750021)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)又稱酞酸酯，是一類人工合成的有機化合物，作為增塑劑、添加劑在塑料、化肥、農藥、玩具、化妝品與涂料等行業中均有廣泛使用[1]。農膜的大量使用被認為是土壤中PAEs重要來源之一，由于PAEs與塑料聚合物高分子碳鏈以氫鍵或范德華力結合，并未真正與塑料化學鍵結合，使得PAEs分子在加工、使用、處置的過程中容易遷移到土壤環境中[2]。土壤中PAEs不僅影響土壤質量、植物的生長和品質，而且在作物中具有一定的生物累積效應，通過食物鏈富集，對生態系統和人體健康構成嚴重威脅[3]。其中，鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]是土壤中檢出率和含量較高的2種PAEs化合物，具有典型的內分泌干擾性和潛在的“三致”效應，被美國環境保護署(Environmental Protection Agency，EPA)列入“優先控制污染物”。一些研究報道了我國不同地區土壤中DBP和DEHP的含量，如北京設施蔬菜基地[4](0.440、0.380 mg·kg-1)，咸陽市郊菜地[5](0.037～6.313、ND～3.871 mg·kg-1)，汕頭蔬菜產區[6](ND～7.652、0.001～4.197 mg·kg-1)，以上地區土壤中DBP和DEHP都為主要的PAEs類污染物。

DBP和DEHP在自然環境中的水解、光解速率緩慢，屬于難降解物質。微生物降解是其主要降解途徑之一[7]。近年來，國內外眾多學者針對PAEs類污染物的微生物降解進行了較多研究，例如針對DBP的Geotrichumsp.[7]、Brucellasp.和Sinobactersp.[8]、變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[9]、Paenibacillussp.[10]、Bacillussubtilis[11]、Gordoniasp.[12]；針對BBP的瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)[13]；針對DEHP的嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)[14]、匯合分支桿菌(Mycobacteriumconfluentis)[15]、Pseudomonassp.[16]、戈登氏菌[17](Gordoniasp.)；針對DMP的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[18]、戴爾福特菌屬(Delftiasp.)[19]。目前，大多數研究針對的是單一短側鏈或者單一復雜的、不容易降解的長側鏈PAEs的生物降解，關于同一菌株同時降解DBP和DEHP的研究較少。研究同一菌株對多種PAEs的降解特性，修復多種PAEs污染的農田土壤，以減少有機污染物對環境的危害和提高農產品質量和安全具有重要應用價值。節桿菌(Arthrobactersp.)是一類革蘭氏陽性菌，能降解多種有機污染物，對于有機污染土壤的修復具有重大意義。已有節桿菌降解PAEs的報道較少，褚嬌艷等[20]研究表明，Arthrobactersp. ZJUTW對DBP有較強的降解能力和較高的耐受性；周長健[21]研究表明，Arthrobactersp. JQ-1能修復DEHP污染的土壤，但是關于節桿菌同時降解DBP和DEHP研究尚未見報道。

本課題組前期對于銀川市東郊設施菜地土壤中PAEs的污染現狀研究表明，該區域PAEs類主要污染物為DBP和DEHP。因此，本研究以銀川市東郊設施菜地土壤為材料，從中篩選出能同時降解DBP和DEHP的菌株，并通過生理生化特征、16S rDNA序列分析技術鑒定菌株，分析不同環境因素對菌株的生長及降解特性影響，以期為該區域PAEs污染土壤的治理和生物修復提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗供試土壤樣品采自銀川市東郊設施蔬菜基地，將采集的鮮樣封存于4 ℃的冰箱中備用。

1.2 培養基配制

無機鹽培養基(MSM)：K2HPO4·3H2O 1.0 g，NaCl 1 g，NH4NO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCl20.1 g，FeCl3·6H2O 0.01 g，定容至1 L，調整pH為7，于121 ℃下濕熱滅菌30 min。固體培養基加瓊脂18.0 g·L-1。

選擇培養基:移取0.2 mL的2 g·L-1的DBP和DEHP混合溶液于100 mL滅菌的無機鹽培養基中，待丙酮完全揮發，即可得到濃度為100 mg·L-1的DBP和DEHP混合無機鹽液體培養基。固體培養基加瓊脂18.0 g·L-1。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，定容至1 L，調整pH為7，于121 ℃濕熱滅菌30 min，固體培養基加瓊脂18.0 g·L-1。

1.3 DBP和DEHP降解菌的篩選、純化與鑒定

稱取10 g土樣，加入盛有90 mL蒸餾水和10 mL玻璃珠的三角瓶，30 ℃，175 r·min-1，振蕩30 min，靜置。取1 mL的上清液接種于含有100 mg·L-1的DBP和DEHP混合的100 mL無機鹽液體培養基中，避光條件下振蕩培養7 d。采用梯度壓力馴化法，按1%的接菌量逐步轉接至300、600、800、1 000 mg·L-1的DBP和DEHP混合無機鹽液體培養基中，每7 d作為1個馴化周期轉接1次，持續進行培養。

取100 μL終期馴化液，涂布于DBP和DEHP混合的100 mg·L-1牛肉膏蛋白胨固體平板上，然后置于30 ℃生化培養箱中靜置培養。待長出肉眼可見菌落后，觀察其生長特征，篩選出長勢最好的菌株，挑取單菌落將其反復劃線接種于新的牛肉膏蛋白胨固體培養基上，直至鏡檢純化為止。將菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作。

1.4 菌株對DBP和DEHP降解能力測定

菌懸液的制備：挑取光滑完整的菌落，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，置于恒溫振蕩器中，30 ℃、175 r·min-1培養48 h。取出牛肉膏蛋白胨液體培養基后，將培養液分裝于100 mL滅菌的離心管中，室溫條件下4 000 r·min-1離心10 min，收集濕菌體。然后用滅菌的0.9% NaCl溶液洗滌3次，再用0.9% NaCl溶液將菌體調配成菌懸液，使其在波長為600 nm下的吸光度為1.0。

將分離純化后的不同菌株，以2%接菌量分別接種到100 mg·L-1的DBP和DEHP混合的100 ml滅菌無機鹽液體培養基，35 ℃，175 r·min-1培養3 d，以不接菌的無機鹽液體培養基作為對照，測定DBP和DEHP的降解率和吸光度，確定最佳降解菌株。每個處理設置3次重復。

1.5 環境條件對降解菌生長和PAEs降解性能的影響

1.5.1 轉速對AS001生長與降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的DBP/DEHP無機鹽液體培養基，調節pH=7，滅菌。分別將2%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機鹽溶液中，在35 ℃條件下分別以0、100、150、175、200 r·min-1振蕩培養3 d，以不接菌液的無機鹽液體培養基為對照，測定DBP、DEHP含量和D600。每個處理設置3個重復。

1.5.2 pH對AS001生長和降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的無機鹽液體培養基，用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH 調整pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，滅菌。將2%菌懸液加入50mL的DBP/DEHP無機鹽溶液中，分別在35 ℃、175 r·min-1條件下振蕩培養3 d，以不接菌液的無機鹽液體培養基為對照，測定DBP、DEHP含量和D600。每個處理設置3個重復。

1.5.3 初始濃度對AS001生長與降解鄰苯二甲酸酯的影響

分別配制總濃度為50、100、200、300、400 mg·L-1的DBP/DEHP無機鹽液體培養基，調節pH=7，滅菌。將2%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機鹽溶液中，在35 ℃、175 r·min-1條件下振蕩培養3 d，以不接菌液的無機鹽液體培養基為對照，測定DBP和DEHP含量、D600。每個處理設置3個重復。

1.5.4 接菌量對AS001生長與降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的DBP/DEHP無機鹽液體培養基，調節pH=7，滅菌。分別將1%、2%、3%、4%、5%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機鹽溶液中，分別在35 ℃、175 r·min-1條件下振蕩培養3 d，以不接菌液的無機鹽液體培養基為對照，測定DBP和DEHP含量、D600。每個處理設置3個重復。

1.5.5 溫度對AS001生長與降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的DBP/DEHP無機鹽液體培養基，調節pH=7，滅菌。將4%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機鹽溶液中，分別在15、25、35、45 ℃，175 r·min-1條件下振蕩培養3 d，以不接菌液的無機鹽液體培養基為對照，測定DBP和DEHP含量、D600。每個處理設置3個重復。

1.6 分析方法

1.6.1 液體中DBP和DEHP的提取方法

參照饒瀟瀟等[22]和王冬瑩[23]的方法，向100 mL的DBP和DEHP無機鹽培養基中加入1 mL的100 μg·mL-1苯甲酸芐酯，加入萃取液乙酸乙酯30 mL，放入恒溫振蕩器中振蕩30 min。轉移至分液漏斗中振蕩5 min，分液，再用30 mL乙酸乙酯沖洗3次，將乙酸乙酯溶液全部轉移到平底燒瓶中。取出凈化柱，依次加入2 g無水硫酸鈉，4 g弗羅里硅土，2 g無水硫酸鈉。先用10 mL乙酸乙酯預洗柱子，棄去該淋洗液，再用50 mL乙酸乙酯洗脫。收集全部洗脫液至雞心瓶中，經旋轉蒸發濃縮至蒸干。加入甲醇定容，過有機系0.22 μm濾膜后進行氣相色譜分析。

1.6.2 生物量的測定

菌株生物量的測定：采用UV-9600紫外可見分光光度計測量培養液在600 nm時的吸光度D600。

1.6.3 PAEs的測定

氣相色譜條件。色譜柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣N2(純度≥99.999%)，進樣口溫度260 ℃，FID檢測器溫度290 ℃，分流進樣，分離比為30，進樣量為1 μL。程序升溫：60 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升至220 ℃，保持1 min；以3 ℃·min-1的速度升至290 ℃，保持5 min。

1.6.4 菌株生理生化特征的測定方法

生理生化特征試驗參照文獻[24]。

1.7 數據處理

數據處理和分析采用軟件Excel，繪圖利用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選、形態和生理生化特征

采用富集馴化法從銀川市東郊設施菜地土壤中分離得到了3株菌株，分別命名為AS001、AS002和AS003。不同菌株對DBP和DEHP降解能力的比較結果(圖1)表明，菌株2即菌株AS001的降解效果最佳。菌株AS001在固體平板上培養，形成的菌落較大，呈淡黃色、濕潤、微凸、黏質不透明(圖2)。無絲狀體，形態呈桿狀，長度約1.2～8.0 μm。菌株AS001革蘭氏染色呈陽性(圖2)，接觸酶、硫化氫、吲哚和V-P試驗呈現陽性，甲基紅、脲酶、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原、酪素水解、淀粉水解試驗呈現陰性。

2.2 菌株的16S rDNA分子鑒定與系統發育樹

由生工生物工程(上海)股份有限公司對降解菌AS001進行測序，測序結果表明，AS001的16S rDNA基因序列大小為1 485 bp，GenBank中序列登錄號為MG569788。在GenBank中進行BLAST比對分析，結果發現，與菌株AS001的16S rDNA序列相似性最高的是節桿菌(Arthrobactersp.)，其同源性達到99%。從GenBank中取同源性高的相關序列作為參考菌株序列，首先用Clustal X將序列進行完全比對，然后用MEGA 5軟件中Neighbor-joining對其做系統發育進化樹(圖3)。如圖3所示，菌株AS001與菌株

圖2 菌株AS001形態和革蘭氏染色結果Fig.2 Colonial morphology and gram staining result of strain AS001

采用鄰接法計算距離，節點上的數值是自展值(%)，括號中為菌株的登錄號。Distances were calculated using neighbor-joining method. The numbers at the branch nodes were bootstrap values (%). Accession numbers of the bacterial isolates were shown in brackets.圖3 菌株AS001和相關菌株的16S rDNA系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain AS001 and other related strains

SD41的親緣關系最近；菌株1132G-1與S15、菌株TD3與A-1、菌株m3與X4的自展值為100；菌株scl-2與前6株菌株的自展值為100，它們之間親緣關系非常相近；菌株ZXY-2與前7株菌株的自展值為99，它們之間的親緣關系也很近。

2.3 環境條件對降解菌的生長和降解性能的影響

2.3.1 轉速對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響

轉速決定了氧氣的供應程度和碳源的分布是否均勻[21]。如圖4所示：總體上，菌株對DBP的降解率高于對DEHP的降解率；隨著搖床轉速增大，降解菌AS001的D600逐漸升高，搖床轉速在150～175 r·min-1時，菌株AS001生長情況較好，且菌株對DBP和DEHP的降解率隨著轉速的增大顯著增加，當轉速為175 r·min-1時，菌株對DBP和DEHP降解率達到最高，分別為85.55%和39.86%，菌株的D600值最大(0.137)，但轉速增加至200 r·min-1時，菌株生長和對DBP和DEHP的降解率迅速下降。主要是隨著轉速的增大，培養液中溶解氧的含量不斷增加，利于菌株的生長和代謝活動而使其生物量不斷增加[25]；但是當轉速太高時，剪切力較大，菌絲容易被打斷，不利于菌絲體生長[26]。

2.3.2 pH對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響

圖5 pH對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響Fig.5 Effect of pH on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

酸堿度是影響細菌生長的又一重要因素，pH能夠影響菌株的酶活性、細胞膜的通透性和酶促反應速率，從而對菌株在轉化有機污染物過程中的生理和生化性質產生影響[21]。由圖5可知，總體上，菌株AS001對DBP的降解率高于對DEHP的降解率。菌株生長及對DBP和DEHP降解率隨著pH的升高先增加后降低，在pH=7時DBP和DEHP的降解率達到最大，分別為80.87%和43.13%，且D600也最大，表明中性環境中菌株生長最好，降解效果最佳；pH超過7后，菌株生長及對DBP和DEHP的降解率均呈緩慢下降趨勢，pH=8時，菌株的D600及對DBP和DEHP的降解率仍呈現較高值；pH>8時，菌株的D600及對DBP和DEHP的降解率呈明顯下降趨勢。說明該菌株可在pH為7～8條件下生長良好，在pH為5～6或者pH>8時，酶活性和酶促反應速率都會受到抑制，從而降低菌株對PAEs的降解。

2.3.3 初始濃度對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響

初始濃度對菌株AS001生長及DBP和DEHP降解率的影響如圖6所示，當底物濃度為50 mg·L-1，菌株對DBP和DEHP降解率分別為60.89%和30.95%；底物濃度為100 mg·L-1時，菌株的D600及對DBP和DEHP的降解率最大，D600為0.13，降解率分別為73.63%和42.58%；隨著底物濃度的繼續升高，菌株生長的D600及對PAEs的降解率顯著下降。表明低濃度的PAEs可為降解菌株提供充足的碳源和能源以滿足其生長代謝需求，但是高濃度PAEs環境會對降解菌產生一定的毒害作用，降低菌株對PAEs的降解能力[27]。在不同濃度條件下，DBP的降解率均大于DEHP，這可能與分子的大小和結構復雜程度有關[23]。一般而言，PAEs側鏈越短，微生物降解效率越高，DEHP屬于長鏈PAEs化合物，相對分子質量較大，但水溶性較低，辛醇-水分配系數較大，不容易被微生物降解；而DBP相對DEHP更容易被微生物降解[28-29]。

圖6 初始濃度對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響Fig.6 Effect of initial concentration on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

圖7 接菌量對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響Fig.7 Effect of inoculum size (V/V) on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

2.3.4 接菌量對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響

不同接菌量對菌株AS001生長及對DBP和DEHP的降解率影響見圖7。總體上，菌株對DBP的降解率高于對DEHP的降解率。接菌量為0時，D600為0.006，菌株對DBP降解率為8.57%，對DEHP的降解率為5.53%。作為空白對照處理，表明自然狀態下轉速等其他因素對DBP和DEHP的降解率會有影響，但影響效果較小，突出菌株對DBP和DEHP的降解效果明顯。接菌量增至1%時，菌株生長速度，以及DBP和DEHP的降解率迅速提高；但接菌量由2%增至4%時，菌株生長及對DBP和DEHP的降解率緩慢增加，D600由0.13增加至0.14，對DBP的降解率由86.05%增長至96.63%，對DEHP的降解率由27.06%增長至35.69%，且兩者降解率均達到最大；當接菌量增加至5%時，菌株生長及對DBP和DEHP的降解率基本穩定，DBP的降解率維持在96.6%左右，DEHP的降解率穩定在35.6%左右。主要原因是，PAEs作為碳源滿足菌株的生長，隨著接種量的增加，高濃度菌液中菌體自身的相互競爭，使得對DBP和DEHP的降解能力增加緩慢。

2.3.5 溫度對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響

溫度是影響細菌生長的重要因素之一，它能夠通過影響微生物的代謝活動，降低酶的活性及DBP和DEHP的溶解度，進而影響PAEs的降解效率[30]。菌株AS001對環境溫度非常敏感，如圖8所示，總體上，菌株對DBP的降解率高于對DEHP的降解率。15 ℃時，菌株AS001的D600為0.06，對DBP和DEHP降解率僅為26.19%和23%，隨著溫度升高，其D600和降解率逐漸增加，25～35 ℃時增加較快，35 ℃時菌株的D600為0.12，對DBP和DEHP的降解率也達到最大，分別為95%和73.65%，降解效果最佳。隨著溫度繼續升高，菌株的生長及對DBP和DEHP的降解率迅速下降，到45 ℃菌株AS001降解能力受到限制，對DBP和DEHP的降解率僅為18%和16.62%。圖8表明，菌株AS001的最佳培養溫度為30～35 ℃，適宜溫度菌株生長較快，生物量增加較快，還可以增加DBP和DEHP在水中的溶解度，菌株的可利用碳源得到一定程度的增加，促進其生長；而低溫和高溫時，菌株基本處于休眠狀態，生長量不高，對PAEs的降解受到抑制[21]。

圖8 溫度對AS001生長及降解DBP和DEHP的影響Fig.8 Effect of temperature on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

3 結論

本研究從設施菜地土壤中分離得到了一株能夠以鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸2-乙基己基酯(DEHP)有機污染物為唯一碳源和能源生長的細菌AS001，經過形態學特征、生理生化特征和16S rDNA序列系統學分析，初步鑒定該菌株為節桿菌(Arthrobactersp.)。菌株AS001的生長及對DBP和DEHP降解的最適宜條件為：175 r·min-1振蕩培養，pH 7.0，初始濃度100 mg·L-1，接菌量4%，溫度35 ℃。在最佳條件下，菌株AS001能高效利用DBP和DEHP作為碳源和能源進行生長，對DBP的降解率明顯高于對DEHP的降解率。