馬鈴薯茄鐮孢菌干腐病生防菌株的篩選、鑒定及其防效

劉治會，郝蓉蓉，許永鋒，楊成德，*，張俊蓮

(1.甘肅農業大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省張掖市植保植檢站，甘肅 張掖 734000； 3.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州730070)

馬鈴薯是重要的糧菜兼用型作物，也是優良的飼料作物，是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物[1]。甘肅省是我國馬鈴薯主產區之一，干腐病是馬鈴薯貯藏期最常見的真菌性病害，嚴重影響馬鈴薯的經濟價值和食用價值，常年發病率為10%～30%，最高達60%[2-4]。茄鐮孢菌(Fusariumsolani)是甘肅省馬鈴薯干腐病優勢病原菌。侵染塊莖后，初期薯塊表面出現黑褐色凹陷病斑，隨后擴大形成較多輪紋狀褶皺；后期薯塊內部變空，干燥時內部長滿白色菌絲，整個薯塊變硬、變輕、干縮，呈灰褐色或深褐色，濕度大時發病部位變紅呈糊狀[5]。

目前，對馬鈴薯干腐病以化學防治為主，常用藥劑有戊唑福美雙、代森錳鋅、戊唑醇、咯菌腈和噻菌靈等殺菌劑，控制效果較好，但容易誘導病原物產生耐藥性、農藥殘留和環境污染等問題[6-7]。生物防治是指利用生物及其代謝所產生的產物來防治植物病蟲害的一種方法，具有無毒、無害、無污染和不易產生耐藥性等優點[8-9]。國內外眾多實驗室已經開始大量篩選、保存可以有效抑制植物病原的生防菌株[10-11]；王瑞霞等[12]分離得到對馬鈴薯環腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum)具有較強拮抗作用的內生細菌P1；暢濤等[13]發現，莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)ZA1對馬鈴薯壞疽病菌具有明顯的抑制作用，且對馬鈴薯貯藏期的多種病原具有較好的抑制作用；關小敏等[14]從馬鈴薯根際土壤中篩選獲得能有效抑制馬鈴薯立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的菌株G1。我國對馬鈴薯干腐病的系統性研究及報道較多，對其在甘肅地區的發生、分布、流行和致病菌的種類等也有較多報道。但是，有關馬鈴薯干腐病生物防治方面的報道較少，僅陳書珍等[15]發現生物農藥枯草芽孢桿菌B2對馬鈴薯窖藏干腐病具有較強的抑菌防病作用。因此，本試驗以甘肅省馬鈴薯干腐病優勢病原茄鐮孢菌(F.solani)為指示菌，從120株內生細菌中篩選拮抗菌，并進行了防效試驗，以期為甘肅省馬鈴薯干腐病的生物防治提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：從甘肅省馬鈴薯上分離獲得的干腐病原菌——茄鐮孢菌QF-4(F.solani)。

供試拮抗細菌：262AG6、B3、YO-71、264ZY10、XSG3、G2、e、O10、261AG3、FQ1、S27、B6、G5、YO-57、264AY3、S21、O55、O56、O61、S26、b、Y0、d、261AY7、261AY2、262AY6、O50、O27、B3、O16、O22、ZMG1、ZMG3、261ZG8、263ZG9、262XG5、265ZY1、265ZY3、265XY6、263XY1、267GG1、267GG2、263ZG7、265ZG8、263XG9、262XG7、QL-1、B6、O44和S30等120株，以上菌株均由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室提供。

培養基：PDA培養基、NA培養基、NB培養液，配方詳見參考文獻[16]。

供試藥劑：70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(陜西美邦農藥有限公司)；枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(德強生物股份有限公司)；265ZY1、265ZY3和265XY6的3種復配菌肥；30%噻呋·嘧菌酯懸浮劑(陜西上格之路生物科學有限公司)。

1.2 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法，以馬鈴薯干腐菌(F.solani)為指示菌，根據抑菌率篩選優良拮抗菌株。

抑菌率(%)=[(對照病原菌菌落直徑-處理病原真菌菌落直徑)/(對照病原菌菌落直徑-菌餅直徑)]×100。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 拮抗菌株的形態觀察

將保存于斜面的拮抗菌株在NA平板上劃線后置于28 ℃恒溫箱中培養，72 h后觀察菌落形態并描述培養性狀及拍照。

將拮抗細菌分別劃線接種于NA平板，培養18～24 h后進行革蘭氏染色，鏡檢拍照[17]。

1.3.2 16S rDNA序列鑒定

DNA的提取。將活化24 h的菌株接入NB培養液，28 ℃振蕩培養12 h，隨后按上海生物工程技術有限公司試劑盒提取DNA。

PCR擴增。利用引物對提取的DNA進行PCR擴增，引物序列分別為5’-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3’和5’-CGG GATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生物工程技術有限公司合成。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性10 s，54 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，35個循環；最后在68 ℃下延伸7 min，4 ℃保存。反應結束后，取5 μL PCR擴增產物經電泳檢測，具特異性條帶的擴增產物送上海生物工程技術有限公司測序。

序列分析。將上海(Sangon)生物工程技術公司所測序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比較(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，選擇同源性達99%以上的序列用Mega(7.0)軟件中的鄰接法構建系統發育樹，確定各菌株的系統發育學地位。

1.4 大田試驗對馬鈴薯干腐病的防效

試驗在張掖市民樂縣南古鎮觀音堂村進行，試驗種薯為大西洋，種植時間為2017年5月6日。微生物菌劑采用草炭、有機肥、骨粉按45%、45%和10%混合作為發酵基質，充分混勻后裝入布袋121 ℃高壓滅菌2 h，按10%(265ZY1、265ZY3、265XY6按1∶1∶1混合)接種量接入種子液，于淺盤中置于28 ℃恒溫培養箱中發酵10 d，后35 ℃烘干并稱取1 g干燥的發酵菌劑采用平板稀釋計數法計算活菌數(CFU·g-1)，菌量達1012CFU·g-1。

將馬鈴薯切為邊長3～4 cm的小塊，用3種菌復配劑(265ZY1、265ZY3、265XY6)3 kg·667m-2拌種處理，以30%噻呋·嘧菌酯懸浮劑設26.5 mL·667m-2、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑設60 g·667m-2和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑設132 g·667m-2作藥劑對照，以清水為空白對照；每處理3次重復，每重復100個薯塊，以播種形式將處理薯塊埋于重茬馬鈴薯田中，30 d后調查薯塊干腐病發生情況，并計算發病率、病情指數和防效[18]。

1.5 數據分析

采用Excel 2007、SPSS 24.0、Mega(7.0)等軟件進行試驗設計與數據處理。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選

從120個供試內生細菌中，經初篩獲得30株對茄鐮孢菌有較好拮抗效果的菌株。復篩得到拮抗效果較強且穩定的菌株265ZY1、265ZY3和265XY6進行后續研究(表1)。

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態及培養性狀觀察

經革蘭氏染色，265ZY1、265ZY3和265XY6菌體均為紫色，即革蘭氏陽性，菌體桿狀(圖1)；265ZY1菌落呈現白色、干燥、扁平、邊緣整齊，表面有褶皺；265ZY3菌落較厚，邊緣整齊表面干癟多褶皺，呈不規則圓形，乳白色；265XY6乳白色半透明菌落，表面多褶皺，邊緣不整齊(圖2)。

2.2.2 16S rDNA 序列分析

利用試劑盒提取菌株265ZY1、265ZY3和265XY6的基因組DNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，提取的DNA片段特異性良好，滿足擴增要求，可以進行PCR擴增。

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，與DL2000Marker比較，約在1 500 bp處有一明亮條帶，其分子量大小與菌株16S rDNA基因序列長度的理論值相符，送上海生物工程技術有限公司測序。

表1 良好拮抗菌株的抑菌率

Table 1 The inhibition rate of antagonistic bacterial strains

菌種Strain抑菌率Inhibition ratio/%菌種Strain抑菌率Inhibition ratio/%菌種Strain抑菌率Inhibition ratio/%265ZY373.00O1071.88264AY371.25265XY672.80O2771.88S2171.15265ZY172.20261AG371.77O5571.04 262AG672.08FQ171.67O5671.04B372.08S2771.67O6170.94YO-7172.08O5071.46S2670.83264ZY1071.98B671.46b70.21XSG371.98G571.46263XY170.10e71.88YO-5771.25O4470.00G271.88QL-171.25S3070.00

圖1 拮抗細菌的革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of antagonistic bacteria

圖2 拮抗細菌的培養性狀Fig.2 Culture characteristics of antagonistic bacteria

將所測序列提交至NCBI中的GenBank數據庫，登錄網址http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi， 用BLAST軟件將菌株265ZY1、265ZY3和265XY6的16S rDNA序列與GenBank中序列進行比較，并下載同源性較高的序列，使用Mega(7.0)軟件鄰接法構建系統發育樹(圖3)，結果表明，菌株265ZY1與死谷芽孢桿菌B.vallismortis(KF818642)聚在一起，相似度達99%；菌株265ZY3與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(KJ149810)聚在一起，相似度達99%；菌株265XY6與甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus(KM817258)聚在一起，相似度達99%。結合形態特征將菌株265ZY1鑒定為死谷芽孢桿菌B.vallismortis，菌株265ZY3鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens，菌株265XY6鑒定為甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus。

2.3 對馬鈴薯干腐病的防效

由表2可知，施用4種藥劑后，馬鈴薯干腐病的發病率為9.17%～20.00%，病情指數為1.76～6.02，空白對照的發病率和病情指數分別為59.17%和22.96，其中，三菌株(265ZY1、265ZY3、265XY6)復配菌劑的防效達79.75%，低于30%噻呋嘧菌酯(防效達92.25%)的防效，但優于70%甲基硫菌靈(防效達73.50%)，與枯草芽孢桿菌防效相似。結果表明，本試驗所得微生物菌劑對馬鈴薯干腐病具有較好防效，說明微生物菌劑具有開發為生物農藥的潛力。

3 討論與結論

表2 四種藥劑對馬鈴薯干腐病的防效

Table 2 Control effect of four fungicides on potato dry rot

藥劑Fungicide用藥量Dosage發病率Disease incidence/%病情指數Disease index防效Control effects/%甲基硫菌靈Thiophanate-methyl132 g·667m-220.00±0.03 b6.02±0.09 b73.50±0.04 c枯草芽孢桿菌Bucillus subtilis60 g·667m-215.83±0.02 bc4.45±0.61 bc80.75±0.03 b三菌株復配30000 g·667m-214.17±0.02 bc4.72±0.25 bc79.75±0.05 bCombination of three strains(265ZY1、265ZY3、265XY6)噻呋嘧菌酯Thiflufur azoxystrobin26.5 mL·667m-29.17±0.04 c1.76±0.10 c92.25±0.02 a對照Control—59.17±0.07 a22.96±0.70 a—

同列數據后沒有相同字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)。

Values with different lowercase letter within the same column meant significant difference among different treatments at 0.05 level.

目前，對馬鈴薯干腐病防治主要依靠化學農藥[19]，隨著大量微生物農藥的開發與應用，生物防治已成為一個熱門的研究領域，發展至今，已經具有較為完整的理論體系和方法。近年來，由于生態環境與食品安全問題逐漸受到社會的關注，從而生物防治得到各方面的大力支持，且研究成果逐步從實驗室走向田間，在農產品安全生產中越來越得到人們的重視。國外對馬鈴薯干腐病的生物防治已取得了較大進展[20]，但國內利用生防細菌防治馬鈴薯干腐病報道相對較少。馬鈴薯干腐病的生物防治首見于Schisler等[21]的報道，他們對威斯康星地區的馬鈴薯田間土壤的300多個細菌與酵母菌株進行篩選，發現有18株細菌對馬鈴薯干腐病具有一定防治潛力。Schisler等[22]在2000年報道了用拮抗細菌來防治貯藏期馬鈴薯干腐病，使貯藏期馬鈴薯干腐病發病率下降了35%～81%。本試驗篩選獲得3株對甘肅馬鈴薯干腐病菌具有良好抑制作用的菌株265ZY1、265ZY3和265XY6，其中265ZY1溶磷能力較強，達40 μg·mL-1，265ZY3、265XY6產IAA較強，分別達110和147 μg·mL-1，且三株細菌能兩兩親和(另文報道)，為甘肅馬鈴薯干腐病生物防治提供了菌種資源和復配防效的依據。

芽孢桿菌是人類發現最早的拮抗細菌之一。具有分布廣、抑菌譜廣、抗性強、無毒等特點，在動植物的生物防治中應用比較廣泛[23]。在農業生產中，芽孢桿菌作為生防細菌對多種病害有防治作用，張猛等[24]報道了死谷芽孢桿菌菌株wm005對油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黃瓜立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearium)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)、水稻惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)表現出很強的抑制作用；張國漪等[25]研究發現，死谷芽孢桿菌HJ-5對棉花黃萎病(cottonvirticilliumwilt)有較好的防治作用；魏新燕等[26]研究發現，甲基營養型芽孢桿菌BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多種脂肽類抗菌物質的基因，該菌株脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)具有較強的拮抗作用；周登博等[27]在天然餅肥發酵液分離獲得甲基營養型芽孢桿菌4-L-16，其對香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等9種病原真菌具有抑菌活性。解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在其自身的生長過程中可以產生一系列的代謝產物，這些代謝產物使得解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛的抑制真菌和細菌的活性。潘虹余等[28]發現，解淀粉芽孢桿菌 B15發酵液對灰葡萄孢具有良好抑菌效果。這些研究表明芽孢桿菌已被廣泛應用于生物防治；且芽孢桿菌在防病的穩定性、與化學農藥的相容性等方面表現出極大地優勢。因此，篩選經濟、高效的生防芽孢桿菌對農業生物防治有極其重要的作用。

本試驗結果表明，菌株265ZY1、265ZY3和265XY6經鑒定均為芽孢桿菌，且對馬鈴薯干腐病菌具有良好的抑菌效果，對馬鈴薯干腐病菌的抑菌率分別為72.20%、73.00%和72.80%；對3菌株復配菌劑進行了模擬大田試驗，其防治馬鈴薯干腐病的防效達79.75%，表明本試驗篩選和鑒定的3株芽孢桿菌具有防治馬鈴薯干腐病的能力。