外源草酸緩解馬尾松根系鋁毒

郭 妮，劉亞敏，周文穎，劉玉民，張盛楠

(西南大學 資源環境學院，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715)

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素，約占地殼總質量的7.1%，通常以無毒的硅酸鹽等形式存在[1]。當土壤pH低于5.5時，土壤中的鋁就會轉變成對植物具有毒害作用的活性鋁[2]，鋁毒害是制約酸性土壤作物生產力的主要因子之一。酸性土壤廣泛分布于我國南方14個省(市、自治區)，總面積約203萬km2，占全國耕地面積的21%[3]。緩解植物鋁毒害已成為土壤酸化區目前亟待解決的問題。

研究認為，植物鋁毒緩解機制主要包括外部排斥和內部耐受2種：外部排斥機制是指阻止活性鋁通過質膜進入共質體，從而防止其到達細胞內的敏感位點，使植物免遭鋁毒害；內部耐受機制是指對于進入共質體的活性鋁，植物通過螯合的方式將其轉化為無毒性或者毒性很小的結合形態鋁，從而緩解植物體內的鋁毒害[4]。研究發現，蕎麥(FagopyrumesculentumMoench.)受到Al3+刺激時根尖會迅速分泌草酸，與Al3+形成無毒草酸鋁復合物，穩定貯存于液泡中，以維持植物細胞質中游離鋁處于低水平[5-6]；當蕎麥根尖有機酸的分泌受抑制時，其根系受鋁毒害較嚴重，也反過來證明有機酸分泌是植物耐鋁脅迫的主要機制[7]。到目前為止，植物可通過分泌不同種類的有機酸來緩解鋁毒已在大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.][8]、小麥(TriticumaestivumL.)[9]、水稻(OryzasativaL.)[10]等植物上得到廣泛證實，添加檸檬酸[11]、蘋果酸[12]等外源有機酸可有效緩解植物鋁毒害也被廣泛報道。

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國亞熱帶地區的主要用材樹種之一，但近年來馬尾松林出現大面積生長衰退甚至死亡的現象。有研究認為，南方地區酸雨加劇引起土壤鋁活化，是影響馬尾松生長從而導致馬尾松大面積死亡的主要原因[13-14]。王水良等[15]研究發現，鋁脅迫下的馬尾松幼苗通過大量分泌草酸和蘋果酸螯合根部有毒的Al3+形成穩定無毒的復合物來實現對鋁脅迫的拮抗；另有研究發現，草酸主要通過分子上與碳原子相鄰的兩個羧基與鋁結合形成五環結構來達到解毒的效果[16-17]。添加外源草酸可緩解鋁毒已經在大豆[18]、小麥[19]、油菜(BrassicanapusL.)[20]等植物上得到證實，但這些研究主要是針對草本植物進行的，目前關于草酸對木本植物鋁毒害是否具有緩解作用及其可能的機制等還不明確。為此，本試驗以耐鋁型和鋁敏感型馬尾松為材料，采用水培法研究不同濃度外源草酸對鋁脅迫下馬尾松幼苗根系形態及生理特性的影響，探討草酸對馬尾松根系鋁毒的緩解作用和最適緩解濃度，揭示草酸對馬尾松鋁毒的緩解作用機制，旨在為酸性土壤中馬尾松林的鋁毒治理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

經前期篩選，本試驗分別選取耐鋁型福建5號(FJ5)和鋁敏感型廣東20號(GD20)馬尾松作為試驗材料，試驗材料的種子由福建省潭平五一國有林場提供。

選取大小一致、圓潤飽滿的FJ5和GD20馬尾松種子，經2% H2O2消毒10 min后，流水沖洗20 min，再用去離子水清洗3次，25 ℃水浴鍋避光浸種24 h，之后將種子均勻播于鋪有一層珍珠巖的培養皿中，恒溫培養箱25 ℃催芽至露白。露白后，將種子播于裝有珍珠巖的育苗盤中，于培養室(恒溫25 ℃，空氣濕度60%，光照強度100 μmol·m-2·s-1)繼續培養，每日光照時間6:00—18:00，定時澆入適量的蒸餾水。待馬尾松第一輪針葉完全打開后，選取長勢一致的幼苗，用紗布固定于避光的玻璃杯(200 mL)蓋上，每瓶3株，用1/5 Hoagland完全營養液(pH值調至4.0)培養，每7 d更換一次營養液，培養6個月即得到試驗所需幼苗[21]。

1.2 試驗設計

兩個馬尾松家系分別設置7個處理(表1)，每個處理設置3組重復，每組6杯，每杯定植3株。供試有機酸選用草酸(OA)，Al3+以AlCl3(分析純)形式加入。處理60 d后測定各指標。

1.3 測定方法

馬尾松總根長、根表面積、根系體積和根直徑采用根系分析儀測定，根系活力采用氯化三苯酚四氮唑(TTC)法[22]測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[23]測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法[24]測定，過氧化氫酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)含量參照張蜀秋[24]的方法測定，丙二醛(MDA)和可溶性糖含量參照張志良等[25]的方法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(G-250)法[26]測定。根尖和根系中鋁含量參照陳榮府[27]的方法進行前處理后采用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)測定，其中，根系鋁含量以鮮重計，根尖鋁含量以單個根尖含鋁的物質的量計。

1.4 主成分分析

表1 試驗設計與處理

Table 1 Experiment design

處理TreatmentAl3+/(mmol·L-1)OA/(mmol·L-1)CK00C00.80C10.80.05C20.80.1C30.80.2C40.80.4C50.80.8

選擇鋁敏感型GD20馬尾松的生理指標進行主成分分析。分析前，先將數據進行標準化處理，轉為無量綱矩陣后再進行統計分析，計算主成分特征根、方差貢獻率。以特征根>1、方差累積貢獻率>80%為提取標準，確定主成分數量[28]。根據各生理指標在主成分中的貢獻率，分析草酸緩解馬尾松鋁毒害的關鍵指標。

標準化處理公式為

(1)

1.5 數據處理

利用Excel 2016軟件對數據進行整理。運用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和主成分分析，對有顯著差異(P<0.05)的處理采用LSD法進行多重比較。采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 草酸對馬尾松根系鋁毒的緩解效果

2.1.1 對根系形態的影響

Al3+對馬尾松的根系生長有抑制作用，且對鋁敏感型馬尾松根系生長的抑制作用要強于耐鋁型，FJ5在C0處理下的總根長、根表面積、根系體積、根直徑較CK分別降低20.38%、24.53%、31.25%、10.26%，GD20在C0處理下的總根長、根表面積、根系體積、根直徑較CK分別降低29.11%、33.49%、50.00%、21.28%。施加外源草酸后，馬尾松受到的鋁毒害均得到一定程度的緩解，隨著草酸施入量的增大，緩解效果總體呈現出先上升后下降的趨勢(表2)。當外源添加的草酸濃度為0.2 mmol·L-1時對耐鋁型FJ5的緩解效果最好，植株總根長、根表面積、根體積及平均直徑分別比C0處理顯著(P<0.05)增加22.12%、33.20%、54.54%和14.28%，且與CK相比已無顯著差異。鋁敏感型馬尾松GD20的總根長和根直徑在C3處理下獲得加鋁條件下的最大值，分別比C0顯著(P<0.05)增加39.12%和16.22%，但根表面積和根系體積在各濃度草酸處理下與C0相比均無顯著差異。

2.1.2 對根系活力的影響

表2 不同處理對馬尾松根系形態的影響

Table 2 Effects of different treatments on root morphology ofP.massonianaLamb.

試驗材料Material處理Treatment總根長Root length/cm根表面積Total surface area/cm2根系體積Root volume/cm3根直徑Root diameter/cmFJ5CK139.86 a17.00 a0.16 a0.39 aC0111.35 c12.83 c0.11 c0.35 bC1116.72 bc13.77 bc0.13 bc0.38 aC2123.91 abc15.03 abc0.15 ab0.39 aC3135.98 ab17.09 a0.17 a0.40 aC4133.45 abc15.86 ab0.15 ab0.38 aC5118.81 abc14.85 abc0.15 ab0.40 aGD20CK131.02 a19.32 a0.24 a0.47 aC092.88 c12.85 b0.12 b0.37 cC1123.39 ab15.15 ab0.15 b0.39 bcC2125.64 ab15.86 ab0.16 b0.40 bcC3129.21 ab14.57 ab0.15 b0.43 abC4128.10 ab15.70 ab0.15 b0.39 bcC5100.40 bc12.97 b0.13 b0.42 bc

同一試驗材料同列數據后無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05 within treatments for the same material. The same as below.

植物根系活力是體現植物根系對礦物質營養吸收能力和呼吸作用強度的重要指標。鋁脅迫降低了馬尾松的根系活力值，與CK相比，C0處理下鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5的根系活力分別顯著(P<0.05)降低64.07%、59.26%，加入外源草酸后，馬尾松的根系活力有所提高，隨外源草酸添加濃度增加總體呈現先上升后下降的趨勢(圖1)。當外源添加濃度為0.2 mmol·L-1時，草酸對馬尾松鋁毒害的緩解效果最好，鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5的根系活力分別為0.23、0.30 mg·g-1·h-1。外源草酸對耐鋁型馬尾松的作用效果更佳，C3處理下，其根系活力與CK相比已無顯著差異。

同一家系柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters in the same family indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 不同處理下馬尾松的根系活力Fig.1 Root activity of P. Massoniana Lamb. under different treatments

2.1.3 對根系抗氧化酶活性的影響

逆境下，植物通過抗氧化酶協同清除體內各種活性氧自由基，以保護膜系統，減輕逆境危害。與CK相比，C0處理下馬尾松的根系SOD、POD、CAT活性顯著(P<0.05)上升。隨著外源添加草酸濃度增加，馬尾松根系SOD活性整體呈現先增加后下降的趨勢。當外源添加草酸濃度為0.2 mmol·L·1時，鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5的根系SOD活性均達到最大值，顯著(P<0.05)高于C0處理。但高濃度的外源草酸(0.8 mmol·L-1)導致耐鋁型馬尾松FJ5的根系SOD活性顯著低于C0處理(圖2-A)。

圖2 不同處理對馬尾松根系抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of different treatments on antioxidant enzymes in roots of P. massoniana Lamb.

隨著外源添加草酸濃度增加，馬尾松根系POD活性同樣呈現先增加后下降的趨勢。當外源添加草酸濃度為0.1～0.2 mmol·L·1時，鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5根系的POD活性均顯著(P<0.05)高于C0處理。耐鋁型馬尾松FJ5根系POD活性在不同濃度草酸處理間差異不顯著，但鋁敏感型馬尾松GD20在C2、C3處理下的根系POD活性顯著(P<0.05)高于其他外源添加草酸的處理，且高濃度的外源草酸(0.8 mmol·L-1)導致鋁敏感型馬尾松GD20的根系POD活性顯著(P<0.05)低于C0處理(圖2-B)。

外源添加0.05～0.2 mmol·L-1的草酸后，耐鋁型馬尾松FJ5的根系CAT活性與C0相比無顯著變化；而當外源添加0.4～0.8 mmol·L-1的草酸后，耐鋁型馬尾松FJ5的根系CAT活性與C0相比則顯著(P<0.05)降低，且顯著(P<0.05)低于CK處理。與此不同，隨著外源添加草酸濃度增加，鋁敏感型馬尾松GD20根系的POD活性則呈現先增加后下降的趨勢。當外源添加草酸濃度為0.2 mmol·L·1時，鋁敏感型馬尾松GD20的根系CAT活性達到最大值，顯著(P<0.05)高于其他處理；當外源添加0.4～0.8 mmol·L-1的草酸后，鋁敏感型馬尾松GD20的根系CAT活性與C0相比顯著(P<0.05)降低，C4處理的根系CAT活性與CK無顯著差別，而C5處理的根系CAT活性則顯著(P<0.05)低于CK處理(圖2-C)。

2.1.4 對根系滲透調節物質的影響

與CK相比，鋁脅迫下(C0處理)的馬尾松根系脯氨酸含量顯著(P<0.05)增加，鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5的根系脯氨酸含量分別為CK的1.73和1.71倍(圖3-A)。除外源添加0.2 mmol·L-1的草酸后，耐鋁型馬尾松FJ5的根系脯氨酸含量與C0相比顯著(P<0.05)降低外，其他處理的根系脯氨酸含量與C0相比均無顯著差異。與此不同，外源添加草酸后，鋁敏感型馬尾松GD20的根系脯氨酸含量與C0相比均顯著(P<0.05)降低，但仍顯著(P<0.05)高于CK處理，且C4、C5處理下根系脯氨酸含量顯著(P<0.05)高于C1～C3處理。

C0處理下鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5的根系可溶性蛋白含量分別為CK的1.37倍和1.93倍，說明鋁脅迫刺激馬尾松根系可溶性蛋白含量顯著(P<0.05)升高(圖3-B)。外源添加草酸后，馬尾松根系的可溶性蛋白含量與C0相比均顯著(P<0.05)降低，與C0相比，耐鋁型馬尾松FJ5的根系可溶性蛋白含量降低39.4%～62.8%，鋁敏感型馬尾松GD20的根系蛋白含量降低27.1%～54.3%。C1～C3處理的耐鋁型馬尾松FJ5根系可溶性蛋白含量間無顯著差異，均顯著(P<0.05)低于C5處理，且C4處理的根系可溶性蛋白含量顯著(P<0.05)低于C5處理。外源添加0.2 mmol·L-1草酸處理下，鋁敏感型馬尾松GD20的根系可溶性蛋白含量最低，顯著(P<0.05)低于其他處理，C1、C2、C4處理的根系可溶性蛋白含量無顯著差異，但均顯著(P<0.05)低于C5處理。

圖3 不同處理對馬尾松根系滲透調節物質的影響Fig.3 Effects of different treatments on osmotic adjustment substances in roots of P. massoniana Lamb.

與CK相比，C0處理下馬尾松根系可溶性糖含量顯著(P<0.05)增加，且對鋁敏感型馬尾松的影響更大，GD20的根系可溶性糖含量較CK組增加94.8%(圖3-C)。外源添加草酸各處理下，耐鋁型馬尾松FJ5的根系可溶性糖含量與C0相比無顯著變化。但外源添加草酸后，鋁敏感型馬尾松GD20的根系可溶性糖含量均較C0處理顯著(P<0.05)降低，并以C2、C3處理的根系可溶性糖含量最低，且顯著(P<0.05)低于其他外源添加草酸的處理。

2.1.5 對根系膜脂過氧化的影響

圖4 不同處理對馬尾松根系MDA含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on MDA content in root of P. massoniana Lamb.

MDA含量是反映植物膜脂過氧化程度的指標，可反映植物受脅迫或損傷的程度。與CK相比，C0處理下馬尾松根系的MDA含量均顯著(P<0.05)上升，說明鋁脅迫下馬尾松根系的膜脂發生過氧化(圖4)。外源添加0.05～0.2 mmol·L-1的草酸后，耐鋁型馬尾松FJ5的根系MDA含量較C0顯著(P<0.05)下降，與CK無顯著差別；外源添加0.4～0.8 mmol·L-1的草酸后，耐鋁型馬尾松FJ5的根系MDA含量與C0、CK均無顯著差別。外源添加0.05～0.4 mmol·L-1的草酸后，鋁敏感型馬尾松GD20的根系MDA含量較C0顯著(P<0.05)下降，但仍顯著(P<0.05)高于CK處理，其中，C3處理的根系MDA含量最低，且顯著(P<0.05)低于其他外源添加草酸的處理；外源添加0.8 mmol·L-1的草酸后，鋁敏感型馬尾松GD20的根系MDA含量較C0顯著(P<0.05)上升。

2.1.6 對根系和根尖鋁含量的影響

如圖5所示，各處理下鋁敏感型馬尾松GD20根系及根尖中的Al含量均高于耐鋁型馬尾松FJ5。外源添加草酸顯著(P<0.05)降低了馬尾松根尖的鋁含量。隨著外源添加草酸濃度的增加，根尖鋁含量呈現出先降低后增加的趨勢，當外源添加草酸濃度為0.2 mmol·L-1時，鋁敏感型馬尾松GD20和耐鋁型馬尾松FJ5根尖鋁含量較C0處理分別降低76.5%和75.1%。外源添加0.1～0.2 mmol·L-1草酸后，鋁敏感型馬尾松GD20根系鋁含量較C0處理顯著(P<0.05)下降；但當外源添加草酸的濃度增大至0.4～0.8 mmol·L-1后，鋁敏感型馬尾松GD20的根系鋁含量較C0處理反而顯著(P<0.05)增加。對耐鋁型馬尾松FJ5而言，僅當外源添加草酸濃度為0.2 mmol·L-1時根系鋁含量較C0處理顯著(P<0.05)下降，當外源添加草酸濃度為0.8 mmol·L-1時根系鋁含量較C0處理顯著增加(P<0.05)，其他處理下根系鋁含量與C0處理并無顯著差異。

2.2 草酸緩解馬尾松根系鋁毒的主導生理因子

圖5 不同處理對馬尾松根系(A)和根尖(B)鋁含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on Al content in roots (A) and root tips (B) of P. massoniana Lamb.

采用主成分分析法，對鋁敏感型馬尾松GD2的SOD、POD、CAT活性，根系活力，以及脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖、MDA含量等8個生理指標進行分析。結果表明，前2個成分的貢獻率分別為51.835%、34.867%(表3)，累計貢獻率達86.701%，表明前2個成分代表了原有8個指標86.701%的信息，可以用這2個成分概括分析外源草酸對鋁脅迫下馬尾松根系生理特性的影響。在主成分載荷矩陣中，特征向量的絕對值反映了其對主成分的貢獻率，絕對值越大，則貢獻率越大。由表4可知，脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量在第一主成分上有較高的載荷，說明第一主成分主要反映馬尾松根系滲透調節物質的信息；SOD、POD、CAT活性在第二主成分上有較高載荷，說明第二主成分主要反映抗氧化酶活性的信息。綜上，脯氨酸和可溶性蛋白含量可能是上述8個生理指標中具有較高代表性的指標，可以作為外源草酸緩解馬尾松鋁毒害的關鍵指標。

表3 主成分分析結果

Table 3 Principle component analysis result

成分Component初始特征值Initial eigenvalue合計Total方差貢獻率Variance/%累積方差貢獻率Cumulative variance/%提取平方和載入Extract square sum loading合計Total方差貢獻率Variance/%累積方差貢獻率Cumulative variance/%14.14751.83551.8354.14751.83551.83522.78934.86786.7012.78934.86786.70130.5366.69793.39840.2082.59895.99750.1932.41598.41260.0630.79199.20370.0410.51499.71780.0230.283100

表4 主成分載荷矩陣

Table 4 Component matrix of principal component analysis

指標Index成分Component12MDA0.900-0.084SOD0.0630.937POD0.1220.955CAT-0.2830.892可溶性糖Soluble protein0.906-0.086根系活力Root activity-0.832-0.422可溶性蛋白Soluble protein0.915-0.108Pro0.9410.015

3 討論

逆境脅迫對植物的次生傷害為滲透脅迫。植物遭受逆境脅迫時，會積累一些可溶性的無機和有機滲透調節物質，如脯氨酸、可溶性蛋白質和可溶性糖等，降低滲透勢，使其在低滲透勢生境下仍能吸收水分，維持細胞水分平衡，保護植株正常生長[36]。本研究結果表明，鋁脅迫下馬尾松根系脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量顯著升高，這與吳成龍等[37]研究結果一致，表明植物根系對外界脅迫敏感，脅迫下會將大量滲透調節物質運送到根系，導致根系滲透調節物質積累。可溶性糖含量的增加主要是通過不溶性碳水化合物的降解及其轉化實現，可溶性蛋白含量升高則主要是由于鋁脅迫誘導了植物抗性蛋白的產生。外源添加草酸后，馬尾松根系脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量均顯著降低。可溶性糖和可溶性蛋白含量降低可能是因為：一方面，有機酸緩解了鋁毒對馬尾松膜脂過氧化的抑制作用，使根系細胞滲透物質含量恢復正常；另一方面，因為草酸緩解了植物鋁毒，植物得以正常生長，此時需要大量能源，可溶性糖作為能源物質被馬尾松大量吸收利用，而可溶性蛋白多是與膜系統特異性結合的酶，主要用來進行生理生化等代謝活動[38]。草酸對馬尾松根系滲透調節物質的影響呈現濃度差異，隨著草酸濃度的增加，3種滲透調節物質均呈現先降低后增加的趨勢，在草酸濃度為0.2 mmol·L-1時有最小值，高濃度草酸處理反而會使滲透調節物質含量增加，這與姚虹宇等[39]在檸檬酸緩解馬尾松鋁毒研究中的結果一致，說明高濃度有機酸會抑制馬尾松鋁毒害的緩解。

總的來看，活性鋁且對馬尾松幼苗產生一定的毒害作用，并使馬尾松根系生理代謝受到影響。鋁脅迫下，馬尾松幼苗總根長、根表面積、根系體積、根系活力等均有所降低，根系抗氧化酶(POD、SOD和CAT)活性、滲透調節物質(可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸)含量均升高，膜質過氧化程度加劇。添加適宜濃度的外源草酸能有效緩解馬尾松幼苗的鋁毒害作用，使馬尾松根系代謝系統得到恢復。添加外源草酸后馬尾松根系活力升高，根系中丙二醛和滲透調節物質含量降低，抗氧化物酶活性維持較高水平，根系鋁和根尖鋁的含量減低(草酸濃度≤0.2 mmol·L-1)，且對鋁敏感型馬尾松的緩解效果好于耐鋁型。草酸緩解馬尾松根系鋁毒害存在濃度效應，以外源添加草酸濃度為0.2 mmol·L-1時緩解效果最好。脯氨酸和可溶性蛋白等滲透調節物質可能是調控草酸緩解馬尾松鋁毒害的主導生理因子。