三種融合標簽對大熊貓輪狀病毒結構蛋白VP6-VP7可溶性表達的影響

文繼鋒，申歡歡，龔永平，易可可，楊智捷，鄧 英，顏其貴

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

大熊貓輪狀病毒(giant panda rotavirus，GPRV)可以引起幼齡大熊貓(5～11月齡)發生傳染性及頑固性腹瀉，導致多器官衰竭死亡，對大熊貓種群的擴大產生一定的影響。輪狀病毒屬于呼腸弧病毒科、輪狀病毒屬，其基因組含11個節段的dsRNA。該病毒的形態呈車輪狀，無囊膜，由三層蛋白衣殼組成，外衣殼由780個分子的VP7及60個分子的VP4聚體狀突起組成，內衣殼由260個分子的VP6三聚體柱狀物組成一個光滑的較低密度的球形殼層，連接VP7和VP2；核衣殼由120個VP2分子包繞著VP1和VP3組成[1]。

結構蛋白VP6、VP7是輪狀病毒的重要功能蛋白，病毒基因的適當組合有利于提高亞單位疫苗的免疫保護效果。VP6蛋白位于病毒的第二層，決定群抗原，并與多種結構蛋白有關。A組輪狀病毒的基因由第6基因片段編碼，全長1 356 bp。VP6蛋白為疏水性蛋白，可以形成三聚體，同時還具有激活轉錄酶的功能，對mRNA的合成起到促進作用。另外，VP6是一種載體蛋白，在適當的條件下可以形成病毒樣顆粒(VLPs)，在維持穩定VP4和VP7的空間結構和增強二者免疫原性方面起著重要的作用。相關研究表明，VP6是介導輪狀病毒黏膜免疫反應的特異性抗原，可刺激機體產生分泌型IgA。VP7是由基因9(或7、8)編碼的一種糖蛋白，是輪狀病毒的重要保護抗原。VP7蛋白能夠獨立誘導機體產生中和抗體，決定病毒的G血清型。隨著原核表達系統的不斷完善和成熟，越來越多的異源重組蛋白實現了在原核表達系統進行高效率的可溶性表達。但是，原核重組表達的病毒蛋白容易出現表達量低和溶解性差的問題。融合標簽技術是20世紀末興起的一種基于報告基因的重組DNA技術，其最初是方便重組蛋白的純化，還可通過改變誘導條件[2]、改變宿主菌[3]、更換表達載體[4]等，促進靶蛋白的可溶性表達。融合標簽的開發和利用不僅方便蛋白質的純化和檢測，而且在增強重組蛋白可溶性、產量及穩定性方面得到廣泛應用。因此，融合標簽是大量生產多種可溶性蛋白質的有效工具。

用蛋白融合表達的方法可以實現大腸埃希菌中異源重組蛋白的可溶性表達，但是很難準確預測不同融合標簽對不同的目的蛋白表達量和促溶效果的影響，所以需要通過預試驗篩選一系列的標簽后確定目的蛋白最適合的融合標簽。GST(glutathione-S-transferase)即谷胱甘肽S-轉移酶，分子量26 ku，來自日本血吸蟲。它作為一種蛋白伴侶被廣泛用于提高靶蛋白在大腸埃希菌中的穩定性，也可以促進靶蛋白在細胞質中的正確折疊和提高重組蛋白的可溶性表達[5]。MBP(maltose binding protein)即麥芽糖結合蛋白，分子量為42 ku，是由大腸埃希菌malIE基因編碼的蛋白，它是細菌麥芽糖轉運系統的成員之一。MBP蛋白親水性強，能夠與多種蛋白融合，作為一個分子伴侶可以幫助靶蛋白正確折疊，常用于靶蛋白的可溶性表達[6]。EDA(E.coli2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase，22.3 ku)，2-酮-3-脫氧-6磷酸葡萄糖酸裂解途徑的關鍵酶，由eda基因編碼。EDA作為一種新的促溶標簽被用于促進異源蛋白在大腸埃希菌中的重組表達。本研究通過將GPRV VP6-VP7基因與攜帶MBP、GST、EDA融合標簽的表達載體相連，研究不同標簽對VP6-VP7蛋白在大腸埃希菌中可溶性表達效率的影響，以篩選出提高VP6-VP7蛋白表達量高和純度高的相關標簽，為進一步制備大熊貓輪狀病毒的基因工程亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒株、載體

大熊貓輪狀病毒CH-1株由本實驗保存。DH5α感受態細胞以及帶有3種融合標簽的質粒(表1)為本實驗室提供。

1.2 主要試劑

DH5a感受態細胞、Rosetta(DE3)感受態細胞及帶有3種融合標簽的質粒(表1)為本實驗室提供。限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，DNA Marker DL2000、DL5000購自大連寶生物有限公司；Plasmid Mini Kit Ⅰ、Gel Mini Kit Ⅰ購自Omega公司；氨芐青霉素、5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液、LB培養基購自北京索萊寶生物科技有限公司；Anti-6×His mouse monoclonal antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG購自上海生工生物工程有限公司；NC膜購自Bio-RAD公司；Pro Ligation-Free Cloning Kit全克隆試劑盒購自加拿大abm公司。

表1 帶有三種促融標簽的載體

Table 1 Carrier carrying three types of proliferative labels

載體名稱Carrier name重組載體組成Recombinant vectorcomposition攜帶標簽大小Carrying tag size/bppET21b6×His-EDA-gene676pET21b6×His-GST-gene739pET21b6×His-MBP-gene1176

1.3 方法

1.3.1 引物設計及合成

根據NCBI已經登錄的GPRVVP6(GU188283)、VP7(GU188284)設計兩對含有相對應同源臂的引物(表2)。

1.3.2 GPRVVP6、VP7基因的擴增

采用病毒總RNA提取試劑盒提取GPRV CH-1株的總RNA，利用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存備用。以cDNA為模板分別進行RT-PCR，擴增GPRV-VP6、GPRV-VP7片段。PCR反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 60 s，循環35個；72 ℃ 5 min。將PCR產物用DNA產物回收試劑盒進行純化，-20 ℃保存備用。

1.3.3 重組表達載體的構建

將實驗室保存的帶有融合標簽EDA、GST、MBP的質粒轉入大腸埃希菌中(DH5α)，37 ℃、180 r·min-1培養1 h后涂布含AMP的LB平板上37 ℃培養10 h。分別挑取單菌落于4 mL含AMP的LB培養基中，37 ℃培養10 h后用質粒小提試劑盒提取質粒。提取后的質粒用EcoRⅠ和XhoⅠ在37 ℃酶切30 min，再用1%瓊脂糖凝膠回收大片段。回收后的載體片段與回收后的GPRVVP6、VP7基因片段的PCR產物利用全克隆試劑盒進行連接反應。反應體系為：2×Pro Ligation-Free全克隆預混液10 μL，酶切后pET21-EDA/GST/MBP載體各1 μL，插入片段GPRVVP6、VP7 4 μL，加入超純水補足20 μL體系，于50 ℃反應1 h。反應完成后將連接反應液轉化至DH5α感受態細胞中，挑取LB平板上的單克隆菌落進行菌液PCR鑒定。將初步鑒定成功的樣品送生工測序。

表2VP6、VP7基因引物設計結果

Table 2VP6，VP7 gene primer design results

引物Primer序列Sequence(5'-3')VP6F: accctcgagggatccgaattcCTTTTA-AACGAAGTCTTCGACATGGR: TACCATACATCTTAATCAACATGCTTCTAATGGVP7F: accctcgagggatccgaattcATGTATGG-TATTGAATATACCACAATTR: GTTGATTAAGATGTATGGTATTGAATATAC

1.3.4 重組表達載體的表達、純化及可溶性分析

將構建成功的質粒pET21b-EDA/GST/MBP-VP6-VP7轉化Rosetta(DE3)感受態細胞，37 ℃、150 r·min-1培養1 h，將其涂布于LB平板(含AMP)上37 ℃培養10 h。分別挑取單菌落于4 mL LB培養基(含AMP)中37 ℃培養10 h。每種菌液分別取1 mL接種到2瓶100 mL LB(含AMP)培養基中，分別標記為E-1、E-2、G-1、G-2、M-1、M-2。37 ℃ 220 r·min-1培養至D600=0.6～0.7時，E-1、M-1、G-1分別加入IPTG(終濃度為1.0 mmol·L-1)，E-2、G-2、M-2作為未誘導組不加入IPTG。把各瓶菌液放置到18 ℃，200 r·min-1搖床培養12 h。取100 μL菌液置于1.5 μL EP管中8 000 r·min-1離心5 min收集菌體，20 μL緩沖液(50 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1NaCl，pH 7.5)重懸菌體加入20 μL 2×SDS蛋白上樣緩沖液，99 ℃處理10 min。其余菌液8 000 r·min-1離心5 min收集菌體。收集到的菌體加入10 mL緩沖液(50 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1NaCl，pH7.5)清洗，清洗后加入10 mL同樣的緩沖液重懸菌體超聲破碎(4 s，10 s，80個循環)。12 000 r·min-1離心30 min上清沉淀分離，誘導組上清和誘導組沉淀分別取樣50 μL，加入50 μL 2×SDS蛋白上樣緩沖液，99 ℃處理10 min。將所有處理過樣品按順序進行10% SDS-PAGE膠檢測，SDS-PAGE膠經過考馬斯亮藍的染色和脫色處理后各種重組蛋白的表達情況和可溶性表達都有比較直觀的結果，再用Image J軟件分析融合蛋白VP6-VP7的可溶性以及表達水平(http://imagej.nih.gov/ij)。

2 結果與分析

2.1 GPRV VP6、VP7基因的擴增

利用RT-PCR方法擴增目的基因GPRVVP6，1%瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)顯示：擴增基因大小1 194 bp，與理論一致。同樣，擴增目的基因GPRVVP7，1%瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)顯示：擴增基因大小981 bp，與理論一致。

2.2 重組表達載體的構建

將2.1節擴增的GPRV VP6、VP7基因與經過EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的質粒pET21b-EDA/GST/MBP利用全克隆試劑盒進行連接反應，轉入DH5a，37 ℃培養12 h。挑取單克隆37 ℃ 220 r·min-1培養10 h，對提取的質粒分別進行酶切鑒定。結果如圖2所示，初步鑒定為陽性克隆，將測序結果用BLAST軟件比對后得出目的序列正確。

M，DL2000 marker；1、2，VP6基因；3、4，VP7基因。M， DL2000 marker; 1， 2， VP6 gene; 3， 4， VP7 gene.圖1 GPRV VP6、VP7基因擴增結果Fig.1 GPRV VP6， VP7 gene amplification results

M，DL5000 marker；1，pET21b-MBP-VP6-VP7質粒；2，pET21b-GST-VP6-VP7質粒；3，pET21b-EDA-VP6-VP7質粒。M， DL5000 marker; 1， pET21b-MBP-VP6-VP7 plasmid; 2， pET21b-GST-VP6-VP7 plasmid; 3， pET21b-EDA-VP6-VP7 plasmid.圖2 重組質粒雙酶切鑒定結果Fig.2 The identification results of recombinant plasmid double enzyme digestion

2.3 重組蛋白表達，純化和可溶性分析

將鑒定正確的重組表達載體pET21b-EDA/GST/MBP-VP6-VP7分別轉化入Rosetta(DE3)感受態細胞，終濃度0.5 mmol·L-1IPTG 18 ℃誘導培養10 h進行誘導表達，同時設置未誘導組作為對照組。結果顯示，pET21b-EDA/GST/MBP-VP6-VP7均在上清中表達，同時未誘導的重組菌體、誘導的重組菌體均存在目的蛋白條帶(圖3、4、5)，EDA/GST/MBP-VP6-VP7蛋白分子量與理論分子質量(104、108、124 ku)相符，Image J對SDS-PAGE膠上融合蛋白VP6-VP7的表達量以及可溶性分析結果見表3。

2.4 Western blot分析

M，蛋白marker；1，未誘導的重組菌體；2，誘導的重組菌體；3，誘導的裂解菌體離心后的上清；4，誘導的裂解菌體離心后的沉淀。M， Protein marker; 1， Uninduced recombinant bacteria; 2， Induced recombinant bacteria; 3， Supernatant of induced lysate after centrifugation; 4， Induced lytic bacteria precipitate after centrifugation.圖3 EDA-VP6-VP7蛋白表達結果Fig.3 EDA-VP6-VP7 protein expression results

M，蛋白marker；1，未誘導的重組菌體；2，誘導的重組菌體；3，誘導的裂解菌體離心后的上清；4，誘導的裂解菌體離心后的沉淀。M， Protein marker; 1， Uninduced recombinant bacteria; 2， Induced recombinant bacteria; 3， Supernatant of induced lysate after centrifugation; 4， Induced lytic bacteria precipitate after centrifugation.圖4 GST-VP6-VP7蛋白表達結果Fig.4 GST-VP6-VP7 protein expression results

表3 攜帶不同融合標簽的重組蛋白VP6-VP7的表達水平以及可溶性

Table 3 The expression levels and solubility of VP6-VP7 recombinant proteins with different fusion tags

目的蛋白Protein標簽Tag標簽大小Size/ku表達水平Expression level/%可溶性Solubility/%VP6-VP7His6-MBP-TEV43.0815.611.2His6-GST-TEV35.2523.330.7His6-EDA-TEV30.4025.276.9

M，蛋白marker；1，未誘導的重組菌體；2，誘導的重組菌體；3，誘導的裂解菌體離心后的上清；4，誘導的裂解菌體離心后的沉淀。M， Protein marker; 1， Uninduced recombinant bacteria; 2， Induced recombinant bacteria; 3， Supernatant of induced lysate after centrifugation; 4， Induced lytic bacteria precipitate after centrifugation.圖5 MBP-VP6-VP7蛋白表達結果Fig.5 MBP-VP6-VP7 protein expression results

將可溶性表達效果最好的融合蛋白EDA-VP6-VP7通過鎳柱親和層析法純化，將純化的目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，把蛋白轉至NC膜上，以小鼠抗6×His單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗。結果顯示，融合蛋白VP6-VP7在NC膜上出現了相對分子質量約104 ku的目的條帶，表明表達的融合蛋白正確且具有蛋白活性(圖6)。

M，蛋白marker；1，His6-EDA-TEV-VP6-VP7蛋白；2，His6-EDA-TEV-VP6-VP7蛋白。M， Protein marker; 1， His6-EDA-TEV-VP6-VP7 protein; 2， His6-EDA-TEV-VP6-VP7 protein.圖6 His6-EDA-TEV-VP6-VP7蛋白Western blot分析結果Fig.6 Western blot analysis of His6-EDA-TEV-VP6-VP7 protein

3 討論與結論

幼齡大熊貓感染熊貓源輪狀病毒會造成極大的經濟損失，以及對大熊貓種群的擴大產生影響，因此選取合適的結構蛋白作為其候選抗原就顯得尤為重要。VP6蛋白是載體蛋白，它可以穩定VP7的空間結構以及增強VP7的免疫原性；另外VP6還可以介導黏膜免疫反應，刺激機體產生sIgA。VP7蛋白是RV主要的外衣殼蛋白中和抗原，可誘導機體產生中和抗原。外源重組蛋白異源表達大多數是以無活性的包涵體形式存在，同時以包涵體形式存在的蛋白在經過變性、復性等復雜過程后有可能影響蛋白質的結構和功能[7-9]。融合標簽的開發和利用不僅方便蛋白質的純化和檢測，而且在增強重組蛋白可溶性、產量及穩定性方面得到了廣泛的應用。因此融合標簽是大量生產多種可溶性蛋白質的有效工具[10]。

本研究通過使用3種不同的融合標簽(EDA、GST、MBP)實現GPRV-VP6-VP7蛋白的可溶性重組表達。實驗結果表明，3種融合標簽都能提高目的蛋白的表達量，但是每種標簽對蛋白的穩定性影響不同。對3種重組蛋白EDA/GST/MBP-VP6-VP7的表達結果進行分析后得到，重組蛋白EDA-VP6-VP7的可溶性表達量最高，其可溶性表達量為重組蛋白MBP-VP6-VP7的2.50倍；重組蛋白MBP-VP6-VP7的表達量比GST-VP6-VP7高，而且其可溶性也比GST-VP6-VP7高，但是融合標簽MBP分子量較大(42 ku)，在表達過程中無疑加大了重組蛋白的分子量。Western blot試驗證實融合蛋白EDA-VP6-VP7具有生物學活性。因此，EDA標簽不僅能夠提高VP6-VP7蛋白原核重組表達的表達量而且還能增強該蛋白的穩定性。本實驗在大熊貓輪狀病毒VP6-VP7基因前嵌入EDA標簽基因，獲得了具有高表達量和高純度的重組蛋白，為后期新型大熊貓輪狀病毒基因工程亞單位疫苗的研制及大熊貓輪狀病毒病的防治和檢測奠定了基礎。