HILIC-MS/MS技術(shù)同時檢測蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷含量的方法學(xué)

張銘雅，朱志銘，姚 迪，陳俏慧，鮑曉文，陳嘉偉，朱健偉，馬 博

(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800)

蛹蟲草(C.militariseL.Fr Link)，又稱北冬蟲夏草、北蟲草，是我國名貴中藥材之一。近年來許多學(xué)者對蛹蟲草做了深入而細致的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[1-2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、免疫抑制[5]及降血糖[6]等多重功效。Xiao等[7]研究表明蛹蟲草中含有核苷類化合物、蟲草酸、蟲草多糖和豐富的人體必需的氨基酸、微量元素等多種生物活性物質(zhì)，其中，核苷類成分主要包括蟲草素、腺苷和肌苷等。而蟲草素是一種具有天然生物活性的核苷類抗生素,其具有的抗氧化作用可以有效逆轉(zhuǎn)酒精性肝損傷[8]。Yong等[9]研究發(fā)現(xiàn)蟲草素可以通過下調(diào)尿酸轉(zhuǎn)運體1(uric acid transporter 1，URAT1)逆轉(zhuǎn)小鼠的高尿酸血癥，同時所具有的抗腫瘤活性，已經(jīng)被用于白血病等惡性腫瘤的輔助治療[10]。腺苷一直以來被用于檢測和衡量蛹蟲草的質(zhì)量標準。肌苷是食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要中間體和活性成分。蟲草酸則具有清除自由基、擴張血管和降低血壓的作用[11]。

蛹蟲草類功能食品的活性成分分析，對其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督控制和活性物質(zhì)的功效研究具有極為重要的意義。目前，已報道的蛹蟲草功效成分的檢測技術(shù)主要有高效液相色譜法(HPLC)和PCR方法[12-13]。但是蛹蟲草成分比較復(fù)雜，背景干擾較大，且有效成分結(jié)構(gòu)相似，具有較高的水溶性，普通的反相色譜柱很難達到基線分離。Yang等[14]采用離子對反相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(IP-RP-LC-MS)有效地定量測定了蛹蟲草中的核酸類化合物，但并未同時檢測蟲草酸的含量。

親水作用色譜(hydrophilic interaction c￣h￣r￣o￣m￣a￣t￣o￣g￣r￣a￣p￣h￣y)是近年來迅速發(fā)展起來的一種分離強極性及親水性化合物的色譜模式[15]。在此基礎(chǔ)上，筆者建立了一種親水作用色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜分析蟲草類物質(zhì)蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的定量方法，并對其方法學(xué)進行考證，以期為蛹蟲草類相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制、篩選高活性蛹蟲草及進一步研究蛹蟲草的功效提供技術(shù)基礎(chǔ)和相關(guān)參考。

圖1 蛹蟲草及成分結(jié)構(gòu)式Fig.1 Cordyceps militaris and structures

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟲草素標準品(純度98%)、蟲草酸標準品(純度98%)，德國Fluke公司；腺苷標準品(純度98%)、肌苷標準品(純度98%)，美國Sigma公司；對乙酰氨基酚(IS，批號：100018-200408)，中國藥品生物制品檢定所；甲酸(色譜純)，美國Fluka公司；甲醇、乙腈(色譜純)，德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Sciex 4000 Q TRAP型質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司； LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司：包括2個LC-20AD型泵、SIL-20AC型自動進樣器、CTO-20AC型柱溫箱、CBM-20A型控制器； BT125D型電子天平，德國Sartorius公司； BT224S型電子天平，德國Sartorius公司； 5810R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司； SPD2010型真空濃縮裝置，美國Thermo公司； Milli-Qintegral 3型超純水機，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

流動相：乙腈-0.05 %甲酸緩沖鹽溶液(體積比為85∶ 15)；流速：0.2 mL/min；色譜柱：Ultimate Hilic Silica 2.1 mm×150 mm,5 μm；柱溫：40 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(turbo Spray)；多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；正離子模式；霧化溫度(TEM)：500 ℃；輔助氣體(GS2)：344.75 kPa；霧化氣體(GS1)：344.75 kPa；氣簾氣體(Curtain Gas)：68.95 kPa；射出電壓(CXP)：10 V；離子噴霧電壓(IS)：4 500 V。蟲草素、蟲草酸、腺苷、肌苷的質(zhì)譜條件見表1。

表1 各物質(zhì)的質(zhì)譜條件

1.3.3 工作液和內(nèi)標溶液的制備

1)內(nèi)標溶液的制備 精密稱取對乙酰氨基酚標準品于10 mL量瓶中，乙腈溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的貯備液，置于4 ℃冰箱保存待用。取適量乙酰氨基酚貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成100 μg/mL的工作液。

2)蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷對照品儲備液的制備 精密稱取蟲草素，蟲草酸，腺苷和肌苷標準品于10 mL量瓶中，乙腈溶解定容，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的貯備液，置于4 ℃冰箱保存。取適量蟲草素貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μg/mL的工作液；取適量蟲草酸貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、100、200和500 μg/mL的工作液；取適量腺苷貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的工作液；取適量肌苷貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的工作液；置4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4 標準曲線及定量下限的測定

分別精密吸取蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷對照品溶液加入乙腈中，配制成含蟲草素的質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的含藥溶液；配制成含蟲草酸的質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μg/mL 的含藥溶液；配成含腺苷的質(zhì)量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的含藥溶液；配制成含肌苷的質(zhì)量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的含藥溶液；進樣并記錄色譜圖。計算待測物峰面積As和內(nèi)標峰面積Ai的比值(=As/Ai)。以峰面積比值對質(zhì)量濃度(q)進行回歸計算，得回歸方程及線性趨勢圖。

1.3.5 精密度與準確度的測定

分別精密吸取蟲草素、蟲草酸、腺苷及肌苷對照品溶液加入乙腈中，配制成含蟲草素的質(zhì)量濃度分別為0.04、0.25和4 μg/mL的含藥溶液；配制成含蟲草酸的質(zhì)量濃度分別為0.4、2.5和40 μg/mL的含藥溶液；配制成含腺苷的質(zhì)量濃度分別為0.004、0.025和0.4 μg/mL的含藥溶液；配制成含肌苷的質(zhì)量濃度分別為0.004、0.025和0.4 μg/mL的含藥溶液作為質(zhì)控樣品(n=6)，進樣后計算精密度和準確度。

1.3.6 穩(wěn)定性考察

配制蟲草素低、中、高質(zhì)量濃度(0.04，0.25和4 μg/mL)；蟲草酸低、中、高質(zhì)量濃度(0.4，2.5和40 μg/mL)；腺苷低、中、高質(zhì)量濃度(0.004，0.025和0.4 μg/mL)；肌苷低、中、高質(zhì)量濃度(0.004，0.025和0.4 μg/mL)的含藥溶液分別置于室溫、4 ℃保存24 h，進樣后計算精密度和準確度。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性考察結(jié)果

對蛹蟲草中4個主要成分(蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷)進行HILIC-MS/MS檢測。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜確定化合物的母離子和子離子色譜圖(圖2～5)，采用MRM模式確定離子對。本試驗采用HILIC色譜柱，等度洗脫。蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的掃描圖及二級質(zhì)譜圖，見圖2～5，保留時間見圖7～8。

圖4 腺苷離子對質(zhì)譜Fig.4 Ion pair map-adenosine

由圖2～5可知:蟲草素的分子離子峰位于252.3；蟲草酸的分子離子峰位于183.1；腺苷的分子離子峰位于268.2；肌苷的分子離子峰位于269.2。圖6為空白生物樣品色譜圖，由圖6可知：內(nèi)源性本底含量較低，內(nèi)標中所含雜質(zhì)不干擾待測藥物的分析。

圖5 肌苷離子對質(zhì)譜Fig.5 Ion pair map-inosine

圖6為定量下限色譜圖，樣品在較低濃度下仍具有較好的靈敏度。由圖6可知：內(nèi)標保留時間在2.49 min左右；蟲草酸的保留時間在4.27 min左右；蟲草素的保留時間在3.21 min左右；腺苷的保留時間在3.52 min左右；肌苷的保留時間在3.49 min左右。圖7為空白生物樣品加內(nèi)標物質(zhì)及待測物質(zhì)色譜圖。色譜圖所示待測物和內(nèi)標峰形良好，無雜峰干擾測定，說明本方法具有較高的特異性。

圖6 LLOQ色譜Fig.6 LLOQ chromatogram

圖7 樣品色譜Fig.7 Sample chromatogram

2.2 標準曲線及定量下限的測定結(jié)果

按1.3.4節(jié)樣品處理方法項操作，分別以蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷各自的峰面積與IS峰面積的比值(Y),對質(zhì)量濃度(X)進行直線回歸(權(quán)重1/X2)，得到蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷回歸方程及定量下限(lower limit of quantification，LLOQ)，蟲草素為Y=0.002X+0.020(R2=0.995 3)，LLOQ為0.02 μg/mL；蟲草酸為Y=0.195 3X-0.002 9(R2=0.999 4)，LLOQ為0.2 μg/mL；腺苷為Y=0.020 4X+0.002 9(R2=0.997 0)，LLOQ為0.002 μg/mL；肌苷為Y=0.018X+0.003 3(R2=0.995 0)， LLOQ為0.002 μg/mL。由此可知：蟲草素在0.02～5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LLOQ為0.02 μg/mL；蟲草酸在0.2～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LLOQ為0.2 μg/mL；腺苷在0.002～0.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LLOQ為0.002 μg/mL；肌苷在0.002～0.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LLOQ為0.002 μg/mL。

2.3 精密度與準確度的測定結(jié)果

將測得的蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷峰面積與內(nèi)標的峰面積比值代入當天的標準曲線計算各批測得質(zhì)量濃度，經(jīng)方差分析求得本法的精密度，并與制備濃度比較求得方法的準確度(表2)。

表2 HILIC-MS/MS法測定蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的精密度與準確度(n=6)

由表2可以看出：蟲草素日內(nèi)精密度范圍在2.33%～4.45%，日間范圍4.87%～8.11%，準確度為-2.5%～1.2%。蟲草酸日內(nèi)范圍在5.11%～9.72%，日間范圍5.43%～8.20%，準確度為-7.1%～3.4%。腺苷日內(nèi)范圍在3.52%～6.23%，日間范圍4.98%～9.32%，準確度為-3.1%～4.2%。肌苷日內(nèi)范圍在4.18%～7.29%，日間范圍5.29%～9.30%，準確度為0.9%～1.8%。以上結(jié)果表明：樣品的低、中和高濃度的精密度、準確度均在±10.0%內(nèi)，符合分析檢測的要求。

2.4 樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果

各儲存條件或處理條件下蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的穩(wěn)定性見表3。由表3可知:低、中和高3

表3 各儲存條件或處理條件下蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的穩(wěn)定性(n=6)

個質(zhì)量濃度的蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷在4 ℃及室溫環(huán)境下的穩(wěn)定性分別為-4.9%～5.5%、-2.1%～2.8%、-1.3%～6.2%和-3.7%～6.6%，證明在室溫放置24 h和自動進樣盤中4 ℃放置24 h后樣品均未發(fā)生降解。

3 結(jié)論

1)建立了一種快速高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時檢測蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的含量的分析方法。蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的色譜圖顯示其峰形良好，無雜峰干擾；4種化合物的標準曲線的線性關(guān)系良好，可滿足實際樣品檢測靈敏度的要求。蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的精密度均小于10.0%，準確度在8.0%左右。4種化合物在室溫放置24 h和自動進樣盤中4 ℃放置24 h均未發(fā)生降解。綜上所述，本方法具有較好的特異性、靈敏度和重現(xiàn)性，可用于蛹蟲草及相關(guān)保健品的檢測。

2)首次采用以HILIC與MS/MS相結(jié)合的形式，建立了同時檢測蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷含量的分析方法，整個色譜的運行時間約8 min，相比于普通HPLC的分離方法，大大提高了分析效率，分離效率高，且腺苷、肌苷的靈敏度可以達到0.004 μg/mL，可以用于蛹蟲草等相關(guān)產(chǎn)品的微量檢測。

3)HILIC-MS/MS的方法中，采用了串聯(lián)質(zhì)譜中MRM的檢測模式，其特點在于檢測限低，能夠檢測到蛹蟲草中的痕量物質(zhì)；且專屬性高，可以完成多個化合物，尤其是結(jié)構(gòu)類似化合物的同時檢測，且特異性高，靈敏度高，能有效提高分析效率。

4)本方法不僅可用于蛹蟲草活性成分的定量分析，同時也為區(qū)別天然蟲草與人工蛹蟲草提供了實驗參考。對于含有蛹蟲草成分的保健品等相關(guān)產(chǎn)品，對其有效成分腺苷和蟲草素也能進行準確地定性定量分析，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制、篩選高活性蛹蟲草及進一步研究蛹蟲草的功效提供了技術(shù)基礎(chǔ)和參考。