忍冬不同藥用部位活性成分的提取及含量分析

李 瓊

(徐州醫藥高等職業學校 制藥工程系，江蘇徐州221116)

忍冬(LonicerajaponicaThunb.)為忍冬科忍冬屬植物，其干燥花蕾或其帶有初開的花部分被稱為金銀花[1]，又稱忍冬花，可供藥用；莖枝名忍冬藤，也可供藥用。忍冬在我國大部分地區多有分布，且不少地方已栽培生產，其中以河南、山東所產最為聞名。忍冬花性寒、味甘，適用于急性熱病的發熱、皮膚腫毒、咽喉腫痛等[2]。該藥材是我國衛生部、國家食品藥品監督管理局規定的貴重品種。近年來，忍冬花蕾在制藥、香料、化妝品、保健品和食品飲料等領域被廣泛使用。若忍冬的藤、葉和根部也能被開發利用，將能產生巨大的經濟和社會效益。

目前，我國學者已對忍冬花蕾中的活性成分進行了大量研究[2-5]，結果發現：忍冬花蕾中主要化學成分為有機酸及黃酮類化合物。還有大量研究表明：忍冬葉、藤和嫩根中都含有一定的黃酮、有機酸等化合物[2-5]。

有機酸被認為是忍冬花蕾中主要起抗菌活性作用的化學物質，也是鑒定及評價忍冬花蕾品質的標志性成分[6]。有機酸類化合物包括綠原酸、異綠原酸等。《中國藥典》2015年版第一部[1]規定：綠原酸干燥品質量分數不得少于1.5%。綠原酸(chlorogenic acid，CHA)是一種多酚類化合物，該化合物除了可以溶解于水，尤其是熱水，還可以溶解于稀乙醇、丙酮等溶劑，是淡黃色的固體，在微酸條件下穩定，分子式為C16H18O9，分子結構見圖1。

圖1 綠原酸分子結構Fig.1 Molecular structure of CHA

黃酮類化合物泛指2個具有酚羥基的芳香環(A-與 B-環)，通過中央3個碳原子互相聯結而成的一系列化合物，其基本母核為 2-苯基色原酮，常與糖結合成苷[7]。忍冬花蕾中主要的黃酮類物質有木犀草苷、木犀草素和蘆丁等。其中，木犀草苷是用來區分忍冬花蕾與山銀花的標志性化合物。

本研究以河南省封丘縣所產忍冬整株生藥作為研究對象，使用乙醇回流提取法、超聲波提取法和索氏提取法3種提取方法對忍冬的花蕾、藤、葉和根部分進行提取；對提取物使用薄層色譜法(TLC)、紫外光譜法(UV)和高效液相色譜法(HPLC)進行定性及定量分析。分析比較幾種提取方法對各部位的提取物中綠原酸和總黃酮含量的影響，以期為選擇適宜的提取方法提供依據，也為忍冬資源的綜合開發和高效利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

供試藥材為河南封丘縣黃德鎮所種植的忍冬(LonicerajaponicaThunb.)“金封一號”，采收于2015年11月底。為排除生長環境對其的影響，選擇生長環境相似，長勢相近且直徑為5 m內的整株忍冬花蕾藥材作為研究對象。取若干株整株藥材，分階段干燥處理，根據文獻[8]的方法處理流程如下：

清洗除去異物泥土等→將生藥材的花蕾、藤、葉和根各部分分開→30 ℃左右烘2 h→40 ℃左右烘8 h→50 ℃烘10 h→60 ℃烘至干透→研磨成粉末狀→過孔徑0.425 mm篩后備用。

無水乙醇、NaOH、HCl(均為化學純)，乙酸乙酯、乙酸(均為分析純)、超純水，徐州南試化學試劑公司；甲醇(色譜純)，合肥博美生物有限公司；250 mL圓底燒瓶、100 mL量筒，江蘇太倉亞邦玻璃儀器廠。

1.2 儀器與設備

FR10型超聲波發生器，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；SY-5000旋轉蒸發儀，上海亞榮儀器廠；300 g(精度0.01 g)電子天平，上海華潮電氣有限公司；TLC層析板，青島海晶化工廠；層析缸，自制；Gel Doc XR型Bio-Rad紫外成像系統，美國伯樂有限公司；10 μL移液槍，徐州南試化學試劑公司；100 mg綠原酸標準品、100 mg蘆丁標準品，中國藥品生物制品鑒定所；10AVP-10AT型高效液相色譜儀(HPLC)，日本島津公司；T6型紫外(UV)-可見分光光度計，南京新中惠科學器材有限公司。

1.3 提取方法

1.3.1 加熱回流提取法

精密稱量忍冬花蕾、藤、葉和根部粉末各10 g，按料液比(g/mL)1∶ 8，分別用體積分數為70%(下同)乙醇溶液混合。在pH為4.0、溫度恒定60 ℃的條件下振蕩回流提取2次，每次提取2 h。此時所得的提取液不僅濃度過低，而且還有鞣質和蛋白質等雜質。故先減壓真空抽濾，再加水沉淀上述雜質。然后在50 ℃水浴下，使用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至10 mL(使得藥液中生藥質量濃度為1 g/mL)，經121 ℃壓力蒸汽滅菌后冷藏于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 超聲波提取法

精密稱量忍冬花蕾、藤、葉和根部粉末各10.0 g，分別用少量體積分數70%(下同)乙醇溶液將粉末預浸12 h；按料液比(體積比為1∶ 8)加入70%乙醇溶液，調節pH為4.0，超聲(25 Hz)提取2次，每次0.5 h；同上先加水沉淀鞣質和蛋白質等雜質，然后在50 ℃水浴下使用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至10 mL(藥液中生藥質量濃度為1 g/mL)，經121 ℃壓力蒸汽滅菌后冷藏于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 索氏提取法

精密稱量忍冬花蕾、藤、葉和根部粉末各10.0 g，按料液比(g/mL)1∶ 8，分別用70%乙醇溶液混合。用超聲波清洗器(25 Hz)處理0.5 h，在pH為4.0、溫度恒定60 ℃的條件下進行索氏提取2次，每次提取2 h[9]。以上述方法沉淀操作后，在50 ℃恒溫水浴下使用旋轉蒸發儀，將提取液濃縮至10 mL(藥液中生藥質量濃度為1 g/mL)，經121 ℃壓力蒸汽滅菌后冷藏于4 ℃冰箱備用。

為了方便后期數據處理，避免混淆和錯誤，將3種方法對忍冬的4個藥用部位的提取物用代碼A、B、C分別表示(表1)。

表1 用不同提取方法提取忍冬不同藥用部位粗提方案的代碼

1.4 綠原酸的TLC鑒定

實驗步驟：配制流動相30 mL，V(乙酸乙酯)∶V(水)∶V(乙酸)為10∶ 3∶ 2；在層析缸中倒入適量流動相，準備表1中的粗提物A1～A4，B1～B4和C1～C4。取10 μL移液槍，逐一吸取以上粗提物溶液，分別點于不同TLC層析板上，待層析板揮發干后，將其置于層析缸內層析，此過程需保證缸體密閉。20 min后取出層析板，置于通風處，揮發干層析板溶劑后，利用Bio-Rad紫外成像系統獲取層析圖譜。

1.5 綠原酸的HPLC定量分析

1.5.1 綠原酸標準的HPLC圖譜測定

按文獻[10]的方法進行HPLC測定。在9.89 min時檢測到的物質為綠原酸，采用外標法(圖2)對待測樣品進行定性分析。

圖2 綠原酸標準品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of CHA standard

1.5.2 線性關系的考察和標準曲線的繪制

取綠原酸標準品和體積分數為50%的甲醇溶液，精密配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 μg/mL的綠原酸標準品溶液，取綠原酸質量濃度為4.0 μg/mL的溶液，設置進樣體積分別為2、4、8、12、16和20 μL。

取已配制好的6個質量濃度(2.0～12.0 μg/mL)的溶液，每個濃度的進樣20 μL，按同樣的色譜條件進行測定，以質量濃度(ρ)為X軸，峰面積(V)為Y軸作標準曲線圖。

1.5.3 重現性考察

精密稱取忍冬花干粉末6份，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50%(體積分數，下同)甲醇至刻度。用功率250 W、頻率35 Hz超聲處理30 min，放冷后用甲醇補足體積，搖勻后濾過，用移液管精密量取續濾液5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，進樣量10 μL，進樣6次。

1.5.4 精密度考察

取配制好的供試液，按上述同樣的色譜條件下進樣量10 μL，進樣6次。

1.5.5 供試品溶液的制備

參照文獻[11]的方法，取以上3種提取方法所得的粗提物A1～A4、B1～B4和C1～C4，用移液管精密量取1 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W、頻率33 kHz)30 min，待冷卻后稱定質量，使用50%甲醇補足損失質量，搖勻后濾過，準確量取續濾液5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度即得。

1.5.6 供試品的測定

逐一量取待測樣品，準確進樣，測定峰面積。然后根據峰面積及回歸方程計算各粗提物中綠原酸的濃度。

1.6 總黃酮的UV定量分析

1.6.1 蘆丁標準品溶液的配制

精密稱取蘆丁標準品37.50 mg(由于蘆丁易吸水受潮，為了準確起見，稱量前需將蘆丁標準品放入120 ℃恒溫箱干燥至質量恒定)，置于50 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇溶解，超聲1～2 min助溶后用95%乙醇定容至50 mL，搖勻備用。

1.6.2 測定波長的確定

參照文獻[12]的方法：首先，準備25 mL棕色容量瓶，精密量取上述已配制好的蘆丁標準品溶液1 mL，加入1 mL體積分數5% NaNO2溶液后混勻；再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻；加入10%NaOH溶液10 mL，再加入 95%乙醇至25 mL，搖勻。取顯色后的溶液適量，于波長400～600 nm范圍內掃描，發現標準品的最大吸收波長為505 nm。因此，確定505 nm為測定波長。

1.6.3 標準曲線的繪制

取蘆丁標準品，配制0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的溶液，以95%乙醇溶液作為空白對照，在波長505 nm處測定吸收度A，以質量濃度(ρ)為X軸，吸收度(A)為Y軸繪制標準曲線。

1.6.4 樣品的制備

參照文獻[13]的方法：精密稱取3種提取方法提取的忍冬各部位的粗提物各10 mL，各取15 mL的乙酸乙酯加入粗提物中，混勻后萃取3次，取上層液，置于60 ℃水浴蒸干后得浸膏。將浸膏加入100 mL容量瓶，用0.5% Na2CO3溶液定容至刻度后，精密量取4 mL該溶液至250 mL容量瓶中，用0.5%Na2CO3溶液定容至刻度，搖勻備用[14]。

1.6.5 樣品的測定

取樣品溶液，以提取試劑為空白，在505 nm處測定吸光度，重復測定3次后計算平均值。

1.6.6 精密度試驗

取忍冬花蕾樣品適量(以黃酮計約6.9 mg/mL)，顯色后測定5次。

1.6.7 回收率試驗

取已知含量的忍冬花蕾樣品1 mL，分別加入蘆丁標準品適量，測定并計算回收率。

2 結果與討論

2.1 綠原酸的TLC定性測定結果

經薄層色譜法(TLC)鑒定，層析20 min后，粗提物A1～A4、B1～B4和C1～C4的圖譜見圖3。由圖3可知：其比移值Rf值為0.68，分離效果較好；說明此方法可以確定忍冬的花蕾、葉、藤和根部中均含有綠原酸。

圖3 綠原酸的TLC定性測定圖譜Fig.3 TLC qualitative determination of CHA

2.2 綠原酸的HPLC定量測定結果

2.2.1 線性關系的考察結果

記錄不同進樣量下峰面積的變化，進樣量與峰面積對應關系見表2。

表2 HPLC法線性關系考察

2.2.2 標準曲線

按上述色譜條件進行測定，以質量濃度(ρ)為X軸，峰面積(V)為Y軸作圖，得綠原酸標準曲線方程Y=51 794X-5 779，R=0.999 2。由此可知在2～12 μg/mL的范圍內線性關系良好(圖4)。

圖4 綠原酸HPLC標準曲線Fig.4 CHA standard curve of HPLC

2.2.3 重現性的考察結果

在同等條件下將6份供試品溶液進樣測定，計算各成分含量的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)，結果見表3。由表3可知：綠原酸含量的RSD為2.47%，表明該方法重復性較好。

圖5 忍冬藤-乙醇回流提取的HPLC圖譜Fig.5 HPLC spectrum of honeysuckle-ethanol reflux extraction

表3 HPLC法的重復性考察

Table 3 Investigation of repeatability relationship by HPLC

序號藥物質量/g峰面積/mm2綠原酸質量分數/%RSD/%11.003 49453.5821.003 59453.5931.006 69583.8041.001 29233.3751.005 59513.7661.005 69513.762.47

2.2.4 精密度的考察結果

取同一供試品溶液，連續進樣6次，每次10 μL，在同等條件下測定并計算各成分峰面積的 RSD，結果表明：綠原酸峰面積的RSD為0.11%，說明精密度良好。

2.2.5 供試品的測定結果

在同樣色譜條件下，逐一取待測樣品，進樣測定峰面積。在9.957 min時檢測到的物質為綠原酸，采用外標法計算，由于樣品較多，僅選用乙醇回流提取的忍冬藤提取物的HPLC圖譜作為代表，結果見圖5。

根據測定的峰面積和回歸方程計算各粗提物中綠原酸的濃度，得3種提取法對忍冬各部位提取物中綠原酸的含量，在忍冬所有部位中均檢測到了綠原酸，結果見表4。由表4可知：同一提取條件下，綠原酸的含量高低依次為花蕾、葉、藤、根部。提取效率最高的是索氏提取法，最低的是乙醇回流法。

2.3 總黃酮含量的UV法測定

2.3.1 標準曲線

取配制好的質量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的溶液，以95%乙醇溶液作為空白對照，在波長505 nm處測定吸光度值，以質量濃度(ρ)為X軸，吸光度(A)為Y軸，繪制標準曲線回歸方程為A=12.124ρ-0.020 7(R2=0.999 7)，結果見圖6。由圖6可知：在0.02～0.10 mg/mL范圍內，蘆丁標準品的線性關系良好。

表4 HPLC法測定綠原酸含量

圖6 UV測定蘆丁標準曲線Fig.6 The standard curve of rutin by UV

2.3.2 樣品的測定結果

取配制好的樣品溶液，以提取試劑為空白，在505 nm處測定吸光度，重復測定3次計算平均值。根據吸光度值計算黃酮含量，結果見表5。由表5可知：同一提取條件下，總黃酮的含量高低依次為忍冬葉、花蕾、藤、根，以索氏提取法的提取效率最高，各部位的黃酮含量普遍較高。

表5 UV法測定總黃酮含量

2.3.3 精密度試驗結果

取忍冬花蕾樣品適量(以黃酮計約6.9 mg/mL)，顯色后測定5次并計算RSD值，結果見表6。由表6可知：黃酮濃度的RSD為0.65%，表明精密度良好。

表6 精密度實驗結果

2.3.4 回收率試驗結果

取已知含量的忍冬花蕾樣品1 mL，分別加入蘆丁標準品適量，測定并計算回收率，結果見表7。由表7可知：平均回收率為100.05%，RSD值為0.46%，說明本實驗回收率較好。

表7 回收率實驗結果

3 結論

1)乙醇加熱回流法、超聲提取法和索氏提取法3種提取方法所得的粗提物，通過TLC定性實驗，發現這3種提取方法對忍冬的花蕾、葉、藤和根的粗提物中都檢測到了綠原酸。

2)3種提取方法所得的粗提物，通過HPLC法對各部位含有的綠原酸定量實驗中發現：綠原酸的含量從高到低依次為花蕾、葉、藤和根部。由此可知：綠原酸含量在花蕾中含量最高，符合《中國藥典》(2015版)規定。

3)3種提取方法所得的粗提物，通過UV法對各部位含有的總黃酮定量實驗中發現：各部位總黃酮的含量從高到低依次為葉、花蕾、藤和根部。由此可知：總黃酮含量在忍冬葉中含量最高。而忍冬葉的產量遠高于忍冬花蕾，約為花的10倍。如果能夠合理開發利用忍冬葉，不僅可以節約能源，還能產生較大的經濟價值。

4)提取效率從低到高排列是乙醇回流提取法、超聲提取法和索氏提取法。索氏提取法提取的忍冬花蕾、葉、藤和根部中綠原酸質量分數分別為4.7%、3.0%、3.2%和2.1%，總黃酮的質量分數分別為6.9%、9.2%、3.6%和1.9%。4個部位中所含的綠原酸都超過了《中國藥典》2015版中規定的1.5%。可見選擇合適的提取方法，對于提高忍冬的綜合利用率很有好處。

綜上所述，本研究通過3種提取方法的對比，得出了提取效率最高的方法，為提高忍冬的提取效率提供了理論基礎。對比同一提取條件下整株忍冬不同部位中的綠原酸和總量酮含量，為忍冬的綜合開發利用提供了理論基礎。