冠突散囊菌發酵黑毛茶提取液的研究

鄒敏敏，董其惠，黃 彥，蘇二正

(1.南京林業大學輕工與食品學院 ，江蘇南京210037; 2.南京林業大學南方現代林業協同創新中心，江蘇南京210037)

茯磚茶屬黑茶類，歷史上主要銷往我國的西北部邊疆等少數民族地區，故又稱為“邊銷茶”。茯磚茶生產歷史悠久，始于唐，盛于明清，在漢族與少數民族的貿易史上占有十分重要的地位。茯磚茶是一種后發酵茶，其中冠突散囊菌是產生其特征風味的優勢菌種[1]。

冠突散囊菌，俗稱為“金花菌”，是屬于散囊菌目發菌科散囊屬的一種真菌，對茯磚茶風味品質的形成具有重要作用[2]，也是國家標準中黑茶種類里唯一有“冠突散囊菌”這一指標的品種[3]。茯磚茶的營養成分非常多，最主要的是維生素、礦物質，特別是茶堿的含量較高。其中包括維生素B1、B2、C 等多種水溶性維生素以及Na、K、Fe、Cu、P及F等28 種礦物質。茯磚茶中的蛋白質、氨基酸及糖類等營養物質也是飲用者的重要營養來源[4]。長期飲用茯磚茶，不但可以預防心腦血管疾病及癌癥，還有明顯的免疫調節、延緩衰老等作用[5]。

目前茯磚茶制造中，選用3～4級黑毛茶為原料，通過篩分、汽蒸、漚堆發酵、稱茶、蒸茶、壓制、包裝、發花、干燥、檢驗等工序精制而成[6]。雖然有關茯磚茶固態發酵制備技術已日漸成熟，但是整個工序步驟繁雜、發酵發花時間長。此外，由于采用固態發酵，發酵環境條件控制困難、管理粗放、衛生條件差。近年來，發酵型茶飲料開始在茶飲料市場嶄露頭角。與傳統的茶飲料相比，發酵型茶飲料有許多突出的優點，比如品質成分得到改善，有效成分增多等。盡管當前還沒有發酵茶飲料國家標準，但是市場上已有參照其他發酵飲料標準開發的紅茶菌、乳酸菌發酵茶飲料。2016年12月7日，國家衛計委新食品原料受理系統接受了冠突散囊菌(CGMCC NO.8730)新食品原料申請(衛食新申字(2016)第0011號)。

基于上述背景，本研究中，筆者擬以黑毛茶為原料，浸提獲得黑毛茶提取液后接種冠突散囊菌，通過培養條件優化，使冠突散囊菌在黑毛茶提取液中的生長繁殖量達到最大化，旨在為后續開發冠突散囊菌液態發酵茶飲品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑毛茶，湖南竹湘記；冠突散囊菌，保藏于南京林業大學發酵食品實驗室；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，青島霍普生物技術有限公司；大豆蛋白、乳清蛋白、脫脂奶粉，上海瑞永生物科技有限公司；葡萄糖、果糖、NH4Cl、CaCl2等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突散囊菌活化

取出-20 ℃保存的菌種，在無菌操作臺上于PDA平板上劃線。在28 ℃、相對濕度85%的條件下恒溫恒濕培養。培養至平板上長有金色閉囊殼后(約72 h)，再次挑取邊緣金黃色的菌落接種到新的PDA培養基上。重復上述操作2～3次。

1.2.2 冠突散囊菌孢子懸液的制備

挑取已培養72 h的冠突散囊菌，轉移到盛有無菌水的三角燒瓶中，加入幾顆玻璃珠，220 r/min振蕩45 min。用血球計數板進行孢子計數，調節濃度，使得孢子懸液的密度為4.8×105個/mL。

1.2.3 黑毛茶提取液的制備

參照文獻[7]的方法。稱取3 g磨碎的黑毛茶茶粉，置于1 000 mL的錐形瓶中，加入450 mL煮沸的蒸餾水，沸水浴浸提45 min，每隔10 min搖動一次。浸提完成后立即減壓抽濾，去除茶渣后將濾液移至容量瓶中，用蒸餾水定容至500 mL，得到質量濃度為6 g/L的黑毛茶提取液。

1.2.4 菌絲干質量的測定

取適量濾紙，80 ℃烘干4 h至質量恒定，分別稱質量并記錄。將發酵完成的菌液用已稱量的濾紙抽濾，濾除濾液，將留有菌絲和孢子的濾紙再次放入80 ℃烘箱烘干6 h至質量恒定，稱量并計算出菌絲干質量[8]。

1.2.5 發酵培養基的優化

以不添加任何其他物質的黑毛茶提取液(6 g/L)為空白組。碳源種類優化選用果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和木糖醇等6種，氮源種類優化選用大豆蛋白、乳清蛋白、脫脂奶粉、尿素、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4和NH4NO3等8種有機和無機氮源，無機鹽選用KCl、ZnSO4、MgSO4、Fe2(SO4)3、NaCl和CaCl2等6種。黑毛茶提取液設3、6、9、12和15 g/L共5個質量濃度進行考察。于500 mL三角瓶中裝150 mL培養液，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫后，每個三角瓶中接種3 mL孢子懸液(4.8×105個/mL)，28 ℃、120 r/min培養72 h，測定菌絲干質量，每組3個平行樣。

1.2.6 發酵條件的優化

以最佳培養基作為發酵培養基，對裝液量、接種量、初始pH、發酵時間這4個參數進行優化。接種量設1、2、3、4、5和6 mL等6個水平；初始pH設3、4、5、6、7和8這6個水平；裝液量設25、50、75、100、125和150 mL這6個水平(V(裝液量)∶V(孢子懸液)=50∶ 1)；在最佳培養基和培養條件下培養，每隔24 h取樣測定菌絲干質量，考察發酵時間的影響。

1.3 理化成分的測定

pH直接用pH計測定；水浸出物含量測定參照文獻[7]；茶多酚含量測定參照文獻[9]；蛋白質含量測定參照文獻[10]；總黃酮測定參照文獻[11]；茶色素測定參照文獻[12]；游離氨基酸含量測定參照文獻[13]；游離氨基酸類別測定參照文獻[14]；香氣成分測定利用氣相色譜-質譜(GC-MS)法進行分析，具體參照文獻[15]。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基成分的優化

2.1.1 碳源對冠突散囊菌生長的影響

碳源在微生物的生長過程中起著不可或缺的作用，在微生物的培養過程中，常用的碳源有糖類、油脂、小分子醇類、有機酸和有機酸酯等。本文中，筆者選取6種糖類作為碳源，冠突散囊菌生長情況如圖1所示。

圖1 碳源種類對冠突散囊菌生長的影響Fig.1 Effects of carbon sources on growth of Eurotium cristatum

由圖1可見：冠突散囊菌在添加碳源的黑毛茶提取液中的生長情況優于空白組，即外加碳源能夠促進冠突散囊菌的生長。其中，葡萄糖的促進效果最好，這與劉作易等[16]、尹旭敏[17]的研究結果一致；麥芽糖的效果次之；果糖、木糖醇和蔗糖的效果相當，三者無顯著性差異；乳糖效果最差。進一步對葡萄糖的添加濃度進行優化，設置10、30、50、70和90 g/L這5個質量濃度進行考察，結果如圖2所示。

圖2 葡萄糖質量濃度對冠突散囊菌生長的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on growth of Eurotium cristatum

由圖2可以看出：冠突散囊菌的菌絲干質量隨著葡萄糖濃度的提高而增加，其增長趨勢在10 ～70 g/L區間較為明顯，在70～90 g/L區間趨于平緩。本實驗中，葡萄糖質量濃度只優化到90 g/L，原因一是考慮到呂嘉櫪等[18]提出，過高的糖濃度會使冠突散囊菌產生無性孢子，從而影響到其有性孢子的數量；二是過高的糖濃度不利于后期發酵茶飲品的開發。因此，選取90 g/L葡萄糖為最佳碳源用量。

2.1.2 氮源對冠突散囊菌生長的影響

冠突散囊菌在生長繁殖的過程中，需要氮源來合成如氨基酸、蛋白質、核酸等菌體細胞物質。筆者選用了4種有機氮源和4種無機氮源，冠突散囊菌生長情況如圖3所示。

圖3 氮源種類對冠突散囊菌生長的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources ongrowth of Eurotium cristatum

由圖3可見：有機氮源中，將尿素添加到黑茶提取液中時，菌體不生長，而其他3種均能促進菌體的生長，效果從高到低依次是乳清蛋白、大豆蛋白、脫脂奶粉；無機氮源中，添加NH4NO3時菌絲干質量最大、(NH4)2SO4次之、NaNO3略高于NH4Cl。該結果與劉作易[16]的研究相一致。由于3種有機氮源添加到黑茶提取液中會使發酵液變渾濁，從而影響成品外觀，此外，由于明令禁止食品中添加NH4NO3，(NH4)2SO4易與Ca2+形成沉淀等原因，最終選取NH4Cl作為最佳氮源。進一步對NH4Cl質量濃度進行優化，設置2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L這6個質量濃度進行考察，結果如圖4所示。

圖4 NH4Cl質量濃度對冠突散囊菌生長的影響Fig.4 Effect of ammonium chloride concentration ongrowth of Eurotium cristatum

從圖4可以看出，NH4Cl質量濃度在0～7.5 g/L時，其菌絲干質量隨著NH4Cl濃度升高而增加；在NH4Cl質量濃度為7.5 g/L時，達到最大值；NH4Cl質量濃度高于7.5 g/L時，菌絲干質量隨其濃度升高而減小。因此，NH4Cl的最佳質量濃度選取7.5 g/L。

2.1.3 無機鹽對冠突散囊菌生長的影響

考慮到發酵液的可食用性，根據食品添加劑標準，選擇了CaCl2等6種無機鹽，研究其對冠突散囊菌生長的影響，結果如圖5所示。

圖5 無機鹽種類對冠突散囊菌生長的影響Fig.5 Effects of inorganic salts on growth of Eurotium cristatum

由圖5可知，除ZnSO4和Fe2(SO4)3外，其他4種無機鹽均能促進菌體的生長，其中CaCl2效果最好。比較KCl、NaCl和CaCl2對菌絲干質量的影響，表明 Cl-對菌體的生長可能存在一定的促進作用，但使CaCl2對菌絲生長起顯著性促進作用的應為Ca2+。具體Ca2+如何影響菌體生長，有待進一步研究。選取CaCl2為最佳無機鹽，對其濃度進行優化，設置2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L這6個質量濃度進行考察，結果如圖6所示。

圖6 CaCl2質量濃度對冠突散囊菌生長的影響Fig.6 Effect of calcium chloride concentration ongrowth of Eurotium cristatum

由圖6可以看出，CaCl2質量濃度為0～2.5 g/L時，菌絲干質量呈直線上升趨勢；5 g/L時，達到最大值；在5～15 g/L時呈下降趨勢，推測原因可能為該濃度區間不利于冠突散囊菌的生長繁殖，也可能為在該區間冠突散囊菌大量繁殖，但受到發酵搖瓶空間及碳氮源的制約，進而阻礙了冠突散囊菌的生長。

2.1.4 黑毛茶提取液濃度對冠突散囊菌生長的影響

對于空白組實驗，在未添加任何碳氮源、無機鹽的黑毛茶提取液中，冠突散囊菌依然可以生長，這說明黑毛茶提取液自身就含有一定量的糖類和小分子氨基酸等物質，可以為菌體生長提供碳氮源等物質，因此推測其濃度也會影響菌體的生長。為此，黑毛茶提取液設3、6、9、12和15 g/L這5個質量濃度進行考察，結果如圖7所示。

圖7 黑毛茶提取液質量濃度對冠突散囊菌生長的影響Fig.7 Effect of extraction solution concentration of raw dark tea on growth of Eurotium cristatum

從圖7可以看出，黑毛茶提取液濃度與菌體生長有顯著的相關性。在3～9 g/L時，菌絲干質量隨著提取液濃度的升高而增加；9 g/L時，達到最大值；質量濃度高于9 g/L時，菌絲干質量隨著濃度升高而降低。這與尹旭敏[17]的實驗結果相似。

通過上述培養基成分的一系列優化，得到了冠突散囊菌液態發酵黑茶的最佳培養基成分及其濃度，以此作為最適培養基培養冠突散囊菌(實驗組)，與未經過優化的黑毛茶提取液進行對比(空白組)，分別研究菌體的生長情況，結果如圖8所示。

圖8 優化前后培養基對冠突散囊菌生長的影響Fig.8 Effects of medium before and after optimizationon growth of Eurotium cristatum

由圖8可以看出，優化培養基培養冠突散囊菌所得的菌絲干質量是空白組的近10倍。此結果表明，通過添加碳氮源、無機鹽及調節黑毛茶提取液的濃度，冠突散囊菌液態發酵的效果得到了顯著提升。

2.2 發酵條件的優化

首先考察接種量對冠突散囊菌生長的影響，結果見圖9。

圖9 接種量對冠突散囊菌生長的影響Fig.9 Effect of inoculum size on growth ofEurotium cristatum

由圖9可知：接種量為0.48×106～2.4×106個時，菌絲干質量隨著接種量的增加而增加；接種量為2.4×106個時，菌絲干質量達到最大值；接種量繼續增加時，菌絲干質量開始減少。出現此現象的原因是，過大的接種量導致茶湯內有限的溶氧量、營養物質不能滿足冠突散囊菌的需要，從而抑了菌體的生長繁殖。因此，選取的最佳接種量為2.4×106個(V(裝液量)∶V(孢子懸液)=20∶ 1)。

黑茶提取液的pH為4.5，上述所有優化均是在自然pH下進行。冠突散囊菌適宜在酸性條件下生長繁殖，產生孢子，如陳桂梅[19]在實驗中發現，冠突散囊菌產孢的最適pH為5；鄧放明[20]在實驗中發現，冠突散囊菌生長的適宜pH為5～7。本實驗pH優化后的結果如圖10所示。

圖10 pH對冠突散囊菌生長的影響Fig.10 Effect of pH on growth of Eurotium cristatum

由圖10可知：當初始pH從3上升到4時，菌絲干質量明顯增加； pH為4時，冠突散囊菌菌體干質量最大；之后，菌絲干質量隨著pH的繼續增大而逐漸減小。此結果證明，過酸、過堿的條件均會導致冠突散囊菌產生無性孢子，使得有性孢子的數量減少，進而抑制冠突散囊菌的生長繁殖[19]。因此最佳pH選定4。

在液態發酵中，溶氧量是一個重要的參數。調節溶氧量的方法有：改變裝液量、攪拌速度等。本實驗中，筆者利用改變裝液量的方法來調節溶氧量，結果如圖11所示。

圖11 搖瓶裝液量對冠突散囊菌生長的影響Fig.11 Effect of loaded broth volume on growth of Eurotium cristatum

由圖11可知：裝液量對菌絲干質量會產生不同程度的影響。裝液量為100 mL時，菌絲干質量最大，約為1.172 g/L，約是裝液量為25 mL時的1.3倍；裝液量超過100 mL時，菌絲干質量隨著裝液量的增加而減小。裝液量的不同，本質上是溶氧量的不同。此結果說明過高和過低的溶氧量都不利于發酵的進行。因此，選擇100 mL為最佳裝液量。

以24 h為單位，以菌絲干質量為衡量指標，考察最佳培養基中，冠突散囊菌在最優發酵條件下的生長進程曲線,結果如圖12所示。

圖12 發酵時間對冠突散囊菌生長的影響Fig.12 Effect of fermentation time on growth ofEurotium cristatum

由圖12可知：前48 h冠突散囊菌生長快速；48～72 h，菌絲干質量呈指數增長，增加量最明顯；72～168 h，菌絲干質量持續增加；168～192 h，菌絲干質量增加趨于平緩；192 h時，菌絲干質量達到最大，之后便逐漸減小，這主要是因為菌體在增長量達到最大值后，開始自溶，從而使菌絲干質量呈緩慢減少的趨勢。綜上，選擇192 h(8 d)為最適發酵時長。

2.3 發酵過程中理化成分的動態變化

發酵過程中理化成分的動態變化如圖13所示。

圖13 發酵過程中理化成分的動態變化Fig.13 Changes of the physicochemical componentsduring the fermentation

由圖13可知：在前48 h內，pH略有下降，因為在這48 h內，冠突散囊菌逐漸繁殖增多，發酵液中碳源不斷被菌體吸收利用，產生酸類代謝產物，溶解到茶湯中，使其pH有所降低；48～120 h，pH逐步從4上升到5，產生此現象的原因可能是發酵培養基中的氮源被分解利用，產生了堿性代謝產物；120～192 h，菌體生長量達到極限，菌體開始自溶，導致pH緩慢上升。

茶水浸出物含有多酚化合物、可溶性糖、水溶性果膠、水溶性維生素、游離氨基酸、咖啡堿、水溶性蛋白、無機鹽等多種物質。茶水浸出物的成分及其含量反映了茶葉品質的優劣[4]。從圖13還可知，在發酵過程中，水浸出物的含量隨著發酵進程的推進而逐漸減少，推測可能是茶湯中水浸出物主要由茶多酚和水溶性蛋白組成，這兩種物質在發酵過程中不斷減少，最終使水浸出物含量緩慢變少。

在發酵過程中，茶多酚的含量逐漸降低，與發酵前相比，減少了36.36%。這說明在發酵期間，冠突散囊菌能夠將茶多酚分解成分子量更小的物質或茶多酚能夠通過自動氧化、酶促氧化等多種途徑轉化成其他物質。該結果與徐瑞瑞等[21]和黃群等[22]的結果一致。144 h后，茶多酚含量降低變緩慢，這是由于隨著發酵時間延長，底物濃度降低，氧化速度相對變緩；同時茶湯pH增加使多酚氧化酶失去最適pH條件而致其活性下降，也致茶多酚氧化速度降低，因此茶多酚含量下降速度也隨之變緩[22]。

在發酵過程中，可溶性蛋白的總含量逐漸減少。在初始24 h內，茶湯中蛋白質含量降低明顯；24～120 h，其含量繼續下降，但趨勢減緩；120～192 h，其下降速度又開始加快。與發酵前相比，發酵結束后水溶性蛋白減少了約53.8%，推測主要原因是茶湯中的大分子蛋白在發酵過程中一部分通過水解反應分解成了氨基酸等小分子物質，另一部分被菌體當作氮源用于自身生長繁殖。

在初始48 h內，游離氨基酸的總量逐漸減少，其原因可能是氨基酸被菌體當做氮源吸收利用，也可能是茶氨酸與茶多酚氧化產物發生結合而生成暗色聚合物或茶氨酸發生了其他氧化、降解和轉化反應[22]；48 h后，游離氨基酸的含量又逐步增加，這可能是因為在此過程中，蛋白質水解、茶多酚等被氧化分解從而釋放出游離氨基酸；對比發酵前后水溶性氨基酸的總量，發現發酵后的氨基酸總量是增加的。對于發酵前后氨基酸種類的比較，如表1所示。發酵后較發酵前增加了3種，分別是絲氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸；減少了1種，為纈氨酸。

表1 發酵前后游離氨基酸類別變化

2.4 發酵過程中功能成分的動態變化

發酵過程中功能成分的動態變化如圖14所示。由圖14可知：發酵前72 h，黃酮類含量隨著菌體的生長繁殖而逐漸減少；72 h后，其含量又逐漸增多。該結果與傅冬和[23]黃酮類物質的含量持續減少的結果不一致，這可能是兩者采用的菌種和發酵條件不同。茯磚茶加工過程中，由于配糖化作用，糖苷一般難以分解，但在高溫高濕作用下，黃酮苷易發生水解，釋放糖基，從而降低茶湯的苦澀味。同時，黃酮類的氧化產物還能與茶湯中的咖啡堿形成絡合物，從而有助于茯磚茶醇和滋味的形成[23]。冠突散囊菌液態發酵過程中，發酵前72 h的黃酮苷也可能基于同樣的原因導致含量下降。就整個發酵過程而言，相比發酵之前，發酵后的黃酮類總量比發酵前增加了25%；后期，由于冠突散囊菌菌體數量的增長，黃酮類總量也不斷增加，由此推測冠突散囊菌自身代謝也可能產生一定量的黃酮類物質。

高品質的黑茶發酵液應當色澤橙紅、明亮。茶湯的色澤變化取決于茶色素的變化。從圖14可以看出，3種茶色素在發酵過程中變化的趨勢各不相同。在整個發酵進程中，茶褐素含量一直在增加：前72 h，增加趨勢較平緩；72 h后，增加速度大幅上升。茶紅素含量較低，隨著發酵的推進，也呈小幅的上升趨勢。茶黃素含量一直較低，48～96 h間只有極微量的變化；96 h后，含量幾乎為零。本實驗所用的黑毛茶為后發酵茶，在其生產過程中，已將大部分的茶黃素轉為茶褐素，所以茶褐素的含量比茶紅素和茶黃素要高出許多。單體兒茶素物質的氧化、聚合和茶多酚的氧化也會導致茶褐素含量的增加。

圖14 發酵過程中功能成分的動態變化Fig.14 Changes of the functional componentsduring the fermentation

茶葉中芳香物質的組成十分復雜，其中包括碳氫類化合物、醛、醇、酮、酯類和內酯類[15]。經過發酵后的冠突散囊菌黑茶發酵液具有獨特的“菌花”香氣，與發酵前的菌液香氣截然不同。發酵前后香氣成分變化如表2所示。

表2 發酵前后香氣成分變化

注：離子化方式為EI源；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃。

由表2可知：發酵前茶湯的香氣成分有5種，除4-辛烯酸乙醚外，其余全由酯類物質構成；發酵后，香氣成分多達17種，比發酵前增加了12種。此處需要說明的是本研究發酵采用的是通風式液態搖瓶發酵，在長時間的發酵過程中，芳香性成分會揮發，此處分析所得到的芳香性物質的結果只是局部的，并不能代表冠突散囊菌發酵可能產生的所有芳香性物質。即使這樣，發酵后茶湯中的揮發性成分大大增加，其中醇類物質占14.29%，醛類物質占7.14%。醇類物質含有溫和清雅的花香，且閾值較低，推測是使發酵后茶湯具有獨特“菌花香”的原因。本實驗中檢測出的香氣成分與虞飛[15]和王華夫等[24]的結果相差較大，一方面可能因為發酵條件、發酵時間不同，導致發酵結束殘留芳香性成分不同；另一方面可能是因為香氣成分具有強烈的揮發性，在常溫下很不穩定，大部分含量甚微的香氣物質在檢測前已揮發。

3 結論

本文中，筆者用6 g/L的黑茶提取液作為發酵的初始培養基，研究了冠突散囊菌在黑毛茶提取液中發酵所需的最佳培養基成分和培養條件，并對發酵前后黑毛茶提取液中各成分的變化進行了測定。結果表明，冠突散囊菌液態培養基的最佳組成為90 g/L葡萄糖、7.5 g/L NH4Cl、5 g/L CaCl2和9 g/L黑茶提取液；最優培養條件為250 mL搖瓶裝液量100 mL、接種量2.4×106個(V(裝液量)∶V(孢子懸液)=20∶ 1)、初始pH 4.0、28 ℃發酵8 d；在最佳培養基和最優培養條件下，其菌絲干質量是初始黑茶提取液、初始培養條件下的近30倍。發酵完成后，通過測定發酵液中的各理化成分發現，茶多酚含量減少了36.36%，總可溶性蛋白含量減少了53.80%，水浸出物含量減少了21.95%，總黃酮苷含量增加了14.40%，游離氨基酸含量增加了76.75%，茶褐素含量增加了5.08%，茶黃素、茶紅素發酵前后含量都較低，可溶性糖含量是發酵前的近4倍，芳香性成分增加了12種，多為酯類和醇類。本試驗為后續開發冠突散囊菌液態發酵飲品提供了理論依據。