高密度發酵重組大腸桿菌產海藻糖合成酶

晏星辰，黃 璞，王鑫沂，姜艷芝，李斯斯，辛 松，江 凌，黃 和

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800；2.南京工業大學食品與輕工學院，江蘇南京211800； 3.南京工業大學 藥學院，江蘇南京211800)

海藻糖是美國食品藥品監督管理局(FDA)認證的功能性低聚糖，在食品、醫藥、化妝品、農業及精細化學品等領域都具有廣闊的市場前景和應用價值[1-2]。目前，工業上酶法生產海藻糖被廣泛應用，海藻糖合成酶(trehalose synthase，TreS)以麥芽糖為底物，通過分子內轉糖基一步催化反應生成海藻糖[3-4]。海藻糖合成酶的異源表達已經有相當好的基礎。Wang等[5]在大腸桿菌BL21(DE3)中表達惡臭假單胞菌的海藻糖合成酶基因，轉化率可達59%；Chen等[6]構建的重組大腸桿菌海藻糖合成酶菌株，轉化率可達68%。通過進一步對發酵工藝優化，快速、高效地獲得高質量的海藻糖合成酶，從而降低生產成本，成為非常有價值的課題。

高細胞密度發酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定的條件和培養體系下，更多地或更高效地獲得細胞量，最終提高單位體積單位時間內目的產物的比生產率[7]。通常認為菌體密度超過50 g/L(以細胞干質量來計算，用DCW表示)即為高密度發酵。目前認為大腸桿菌最高的菌體密度為200 g/L[8-9]。高密度發酵大腸桿菌X90產胰蛋白酶，菌體密度可達92 g/L[10]；高密度發酵大腸桿菌HB101產青霉素酰化酶，菌體密度可達145 g/L，均極大地提升了產酶效率[11]。高密度發酵可以減少培養體積，縮短生產周期、減少設備投資，進而降低生產成本。高密度發酵重組大腸桿菌對發酵條件有非常高的要求。滿足細胞生長所需的營養物質、細胞生長過程中代謝抑制物的積累、培養溫度、pH、溶氧濃度、誘導方式和補料方式等都對高密度發酵有非常重要的影響[12-14]。其中最重要的則是補料方式的選擇，分批補料技術為目前普遍采用的發酵方式。分批補料方式包括非反饋補料法和反饋補料法[15-16]。非反饋補料法包括恒速流加補料法、變速流加補料法和指數流加補料法。其中，指數流加法可以比較精確地控制細胞的比生長速率，對細胞的生長和蛋白的表達效果較好。但是，它對發酵環境的適應性和調節性不強，不能根據發酵環境和菌體生長的變化作出相應的反饋調節。反饋補料法包括殘糖濃度反饋法，恒溶氧反饋流加法和pH-stat反饋流加法。但是，反饋式補料法有一定的滯后性，無法進行精確的實時調控。因此，研究出既能克服非反饋補料法的適應性和調節性差的缺點，又能避免反饋補料法的滯后性的全新補料方式，具有十分重要的現實意義。

本研究中，筆者首先在揺瓶中對高細胞密度發酵重組大腸桿菌產海藻糖合成酶的培養基組成、培養條件和誘導條件進行確定，再在5 L發酵罐中對該菌進行批次補料的發酵實驗，最后采用變指數-恒pH法的發酵方式進行高密度發酵實驗，以期系統地優化重組大腸桿菌產海藻糖合成酶高細胞密度表達的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

重組基因工程菌大腸桿菌BL21(Escherichiacoli)，筆者所在課題組構建，目的基因來自于異常球菌(Deinococcussp.)。

1.2 主要試劑

葡萄糖、麥芽糖、海藻糖標準品，Sigma公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；氨芐青霉素、異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1B(U)型生物凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；HYL-A型恒溫搖床，太倉市強樂實驗設備廠；GA88-II型超聲破碎儀，無錫上佳生物科技有限公司；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀，Dionex公司；RI-101型示差折光檢測器，Shhodex公司。

1.4 主要溶液與培養基

IPTG(1 mmol/L)：10 mL無菌水溶解2 g IPTG，經0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃貯存。

氨芐青霉素(Amp,100 mg/mL)：10 mL無菌水溶解1 g氨芐青霉素鈉，經0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃貯存。

LB固體培養基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂 20 g，定容至1 L。滅菌冷卻后加入Amp母液，使其終質量濃度為50 mg/L。

LB液體培養基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，定容至1 L。接種時加入Amp母液，使其終質量濃度為50 mg/L。

發酵培養基：葡萄糖10 g/L(單配)、KH2PO413.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.39 g/L、酵母粉3 g/L、(NH4)2HPO44 g/L、NH4Cl 2.7 g/L、一水檸檬酸 1.89 g/L。微量元素為FeSO4·7H2O 5 mg/L、MnSO4·H2O 2 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L、CoCl21.6 mg/L。

1.5 試驗方法

1.5.1 重組大腸桿菌發酵生產海藻糖合成酶

揺瓶培養：初始種子接入到含有50 mg/L的LB培養基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養。轉接體積分數2%的種子液到新鮮的發酵培養基(含50 mg/L Amp)中，溫度37 ℃，轉速200 r/min，培養種子6～7 h時，加入誘導劑IPTG，使其終濃度為0.8 mmol/L。

發酵罐培養：在5、15和50 L發酵罐中裝入1/3體積的初始發酵培養基，補料體積為1/3發酵罐體積。接種量5%。初始溶氧可控階段，通過串聯攪拌和通氣量使溶氧(DO)保持在15%以上，直至不可控。發酵初始pH為7.0，控制發酵pH維持在7.0±0.1。

指數流加：根據菌體生長需要營養物質和發酵液體積的變化，指數補料流加葡萄糖，控制平均比生長速率在0.1及0.2 h-1左右。

變指數-恒pH混合流加：在發酵開始階段，控制比生長速率0.2 h-1，在誘導階段控制比生長速率0.1 h-1，并在整個發酵過程中，保持pH恒定。

酶液的制備：發酵培養出來的發酵液經離心、洗滌、1/2體積重懸。細胞懸液經超聲破碎、離心之后獲得酶液。酶液保存于4 ℃，用作催化生產海藻糖。

1.5.2 海藻糖合成酶的酶活力測定方法

取麥芽糖試劑(化學純)5.4 g，溶解于100 mL、pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，使其終濃度為150 mmol/L。800 μL麥芽糖溶液與200 μL細胞懸浮液混勻(每組3個平行)，1 mL反應體系在25 ℃反應30 min，之后沸煮8 min，用來滅酶。6 000 r/min離心8 min，取上清液用來測定得到的海藻糖的含量。

酶活力定義：在25 ℃下，每1 min生成1 μmol海藻糖所需要的海藻糖合成酶的量為1個酶活力單位U。

1.5.3 高效液相色譜法測定產物與底物

使用高效液相色譜法測定樣品中麥芽糖、葡糖糖和海藻糖的含量。測定條件為流動相V(乙腈)∶V(水)=3∶ 1，流速0.6 mL/min；選用氨基柱(柱溫35 ℃)，Shodex RI-101示差檢測器。

2 結果與討論

2.1 最佳接種時間的確定

分批培養種子的過程中，細胞從延滯期開始慢慢復蘇，之后進入比生長速率最大的對數生長期；進入發酵后期，細胞的增殖速度減慢甚至為負增長[17]。所以選擇對數生長的中后期為接種時間，此時細胞活力和質粒的穩定性都較強，可以縮短發酵周期，降低染菌的可能性，保證重組蛋白的高效表達。通過搖瓶實驗測定一代種子和二代種子的生長曲線，以確定最佳接種時間，結果如圖1所示。

圖1 一代種子和二代種子生長曲線Fig.1 Growth curves of the first and second seed

由圖1可知：一代種子的2～8 h為菌體的對數生長期，二代種子的2～6 h為菌體的對數生長期。在對數生長期之后，菌體的比生長速率開始下降。因此，一代種子培養6～7 h即可接種，二代種子培養4～5 h即可接種，即當達到該體系下最大OD600的1/3至1/2時即可接種。由此可以看出，二代種子的活性明顯強于一代種子。為了避免傳代次數過多而導致質粒丟失，種子活化到二代即可。

2.2 發酵培養基的優化

2.2.1 葡萄糖濃度的優化

大腸桿菌高密度發酵使用的半合成培養基，其各成分的濃度及比例對發酵影響很大[18]。碳源是大腸桿菌高密度發酵的最關鍵因素，而目前最常用的碳源是葡萄糖。如果葡萄糖濃度過高，一方面會導致菌體生長過快，造成質粒丟失，影響目的蛋白的表達；另一方面，后期會抑制菌體生長，導致葡萄糖效應，使得菌體總量偏低[19]。筆者研究不同葡萄糖濃度對OD600和酶活的影響，結果如表1所示。

表1 葡萄糖質量濃度對OD600和酶活的影響

由表1可知：重組大腸桿菌在10 g/L葡萄糖的培養基中生長迅速，培養10 h后，菌體OD600達到5.6±0.3，海藻糖合成酶酶活也達到(3 245±250) U/mL，高于含5 g/L和15 g/L葡萄糖的培養基所獲得的OD600和酶活。同樣的，培養基中初糖質量濃度為10 g/L時，重組大腸桿菌的菌體密度以及其他異源蛋白(如谷胱甘肽(GSH)、重組人骨形成蛋白-2A)的表達量亦均達到了高值[20-21]。研究表明，如果培養基中糖濃度過高，則會導致大量乙酸形成，而糖質量濃度超過50 g/L時，重組大腸桿菌的生長將受到抑制[22]。

2.2.2 氮源的選擇

除碳源外，培養基中的氮源對大腸桿菌發酵也有較大影響[23]。常用的氮源包括有機氮源和無機氮源。微生物吸收無機氮源快于有機氮源，但在含有有機氮源的培養基中常表現出生長旺盛、菌體濃度較高的特點。因此，筆者選用酵母粉、(NH4)2HPO4、NH4Cl、有機氮源和無機氮源相結合的培養基，不同氮源對OD600和酶活的影響，結果如表2所示。

表2 氮源對OD600和酶活的影響

由表2可知：選用有機氮源和無機氮源相結合的培養基，發酵10 h得到菌體OD600為5.2±0.1，酶活為(6 500±150) U/mL，高于只含單一有機氮源培養基得到的OD600和酶活。所以選擇有機氮源和無機氮源一起作為培養基的氮源，酵母粉3 g/L、(NH4)2HPO44 g/L、NH4Cl 2.7 g/L。

2.2.3 微量元素的選擇

表3 微量元素對OD600和酶活的影響

由表3可知：加入微量元素的培養基發酵10 h得到的OD600為5.2±0.3，酶活為(3 221±270) U/mL，高于不添加微量元素的培養基相同培養條件下得到的OD600和酶活。所以，培養基中添加一定濃度的微量元素。

2.3 培養條件及誘導條件的優化

2.3.1 pH的優化

培養基的初始酸堿度直接影響培養基中的物質和菌體中間代謝產物的解離，從而影響菌體對營養物質的新陳代謝[25]，大腸桿菌適合生長的pH為6.5～7.5，如果生長pH不在此范圍內，菌體的生長就會受到抑制甚至死亡。本實驗中，筆者考察發酵培養基初始pH分別為6.6、7.0和7.4時對菌體生長和蛋白表達的影響，結果如表4所示。

表4 pH對OD600和酶活的影響

由表4可知：初始pH 為7.0時，OD600達到5.2±0.3，酶活達到(3 345±250) U/mL，均高于初始pH 6.6和初始pH 7.4時的OD600以及酶活。尤其在偏堿性條件下，重組大腸桿菌質粒丟失嚴重，幾乎沒有酶活。因此，選用初始pH 7.0作為發酵條件。

2.3.2 誘導溫度的優化

培養溫度是菌體生長和新陳代謝的重要因素。在不同發酵階段,基因工程菌的最適溫度需要綜合考慮。在菌體處于生長期、重組產物還沒有表達時，較高的溫度有利于菌體量的積累，并可縮短培養周期。較高培養溫度會降低基因工程菌的質粒穩定性，并且較低的溫度培養能提高目的重組產物的表達量[26]。所以，發酵到目的重組產物表達時期，應該采用低溫培養。筆者研究不同溫度對OD600和酶活的影響，結果如表5所示。

表5 溫度對OD600和酶活的影響

由表5可知：本實驗在發酵生長期采用37 ℃條件培養菌體，在產物表達時期采用32 ℃條件誘導菌體。相較于采用37 ℃恒溫條件培養，OD600基本保持不變，但酶活有顯著提高。因為高溫條件下利于菌體生長，當菌體積累到一定數量時，發酵受到各種限制因子的影響，菌體數量不再增加。此時，采用低溫條件培養，菌體生長活性降低，將更多的能量用于自身蛋白的表達，有利于獲得更多的目的蛋白。因此，后期選用32 ℃作為誘導條件。

2.3.3 誘導劑添加時間的優化

由于IPTG對菌體有毒害和增加菌體代謝負擔的作用，所以添加IPTG的時間對菌體的高密度發酵和產物的積累有直接影響。添加時間過早不利于獲得較高的生物量和產物總量，添加時間過晚，增加了發酵后期的生產成本。分別在發酵2、4和6 h，即分別為揺瓶最大生物量的1/6、1/2和2/3時添加IPTG，其他培養條件相同，發酵10 h，研究IPTG添加時間對OD600和酶活的影響，結果如表6所示。

表6 IPTG添加時間對OD600值和酶活的影響

由表6可知：發酵4 h時添加IPTG效果最佳，OD600為6.2±0.3，酶活為(6 345±250) U/mL；發酵2 h時添加IPTG，由于菌體濃度過低，IPTG對菌體的毒害效果顯著，導致菌體數量和酶活都非常低；而發酵6 h時添加IPTG，雖然對菌體數量沒有影響，但是由于菌體此時表達蛋白能力的降低和誘導時間的不足，獲得的酶活效果并不理想。如果增加誘導時間，則會導致發酵時間的增加，也增加了成本。因此選用OD600為最大生物量的1/2時添加IPTG。

2.4 分批發酵

經過搖瓶培養的初步研究，基本確定了培養的各個參數，但搖瓶的培養環境和參數與發酵罐相比相差很大。發酵過程中，發酵罐對pH、溶氧等因素的可控程度很高。因此，先在5 L發酵罐上進行分批發酵實驗，作為發酵罐的分批補料發酵實驗的基礎，結果如圖2所示。

圖2 分批方式下重組大腸桿菌的發酵曲線Fig.2 Fermentation curves of recombinant E. coli underthe conditions of batch fermentation

由圖2可知：在發酵過程中，利用NaOH控制pH在7.0，通過攪拌和改變通氣量來維持溶氧20%以上，至達到攪拌和通氣量上限，便不再維持。由于pH值和溶氧在發酵罐培養過程中是可控參數，發酵罐中的環境特別適合菌體生長，菌體密度比揺瓶有了顯著提高。OD600達到12，酶活最終達到了(6 010±120) U/mL。發酵6 h，葡萄糖已經基本消耗完畢，之后菌體生長放緩。由于營養物質缺乏，所以菌體密度和海藻糖合成酶活力還有很大的提升空間。此分批發酵實驗為分批補料奠定了基礎。

2.5 分批補料技術

2.5.1 指數流加法

分批補料技術是指在微生物分批發酵過程中流加一定營養物質，用來提高菌體密度和目的蛋白含量的技術[27]。Riesenberg等[28]采用非反饋分批補料技術中的指數流加法，控制大腸桿菌比生長速率為0.11 h-1，獲得110 g/L的生物量(以DCW計)。非反饋控制的系統中，物料的程序是預先設定的。但在實際培養過程中，菌體的生長不會和理論設想一致，非反饋補料法便不能發揮其原有的調節作用。因此，非反饋補料法靈活性不強，不能根據菌體生長的實際情況作出相應的調節，所以往往蛋白表達量不理想。表7為指數流加試驗結果。

表7 指數流加試驗結果

由表7可知，指數流加方式極大地提高了菌體密度。當比生長速率μ為0.2 h-1時，在較短的時間里獲得了較高的菌體密度。采用指數流加策略，可以控制基本恒定的比生長速率(0.2 h-1)。

2.5.2 變指數流加-恒pH法

圖3 5 L罐變指數流加-恒pH流加方式下重組大腸桿菌發酵曲線Fig.3 Fed-batch fermentation profiles using combinedfeeding strategy in 5-L fermentator

圖4 50 L罐變指數流加-恒pH流加方式下重組大腸桿菌發酵曲線Fig.4 Fed-batch fermentation profiles using combinedfeeding strategy in 50-L fermentator

由圖3可知：在發酵初始階段，首先采用指數流加培養(μ=0.2 h-1)，開始誘導時，降低比生長速率為μ=0.1 h-1，在整個發酵過程中，保持恒定的pH值在7.0左右，直到發酵結束。這種補料方式成功克服了單一流加方式的缺點，成功地避免了發酵過程中乙酸的大量積累，為大腸桿菌的高密度生長創造了條件。50 L罐的發酵結果如圖4所示。由圖4可知：由于50 L罐設備的環境更好，各個參數可控程度更高，溶氧充足，發酵32 h后，OD600達到97，酶活達到(24 000±350) U/mL，實現了大腸桿菌的高密度發酵。

3 結論

采用全新的變指數-恒pH法高密度發酵重組大腸桿菌，對生產海藻糖合成酶條件進行系統優化。首先在揺瓶中，根據大腸桿菌高密度發酵條件范圍，對本實驗的基因工程菌進行培養基、發酵條件和誘導條件的優化。得到培養基組成：葡萄糖10 g/L(單配)，KH2PO413.5 g/L、MgSO47H2O 1.39 g/L，酵母粉3 g/L、(NH4)2HPO44 g/L、NH4Cl 2.7 g/L、一水檸檬酸 1.89 g/L。微量元素為FeSO4·7H2O 5 mg/L、MnSO4·H2O 2 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L、CoCl21.6 mg/L。發酵條件：二代種子培養4～5 h接種，pH 7.0，發酵初期溫度37 ℃，誘導溫度32 ℃，當達到發酵體系最大生物量的1/3～1/2時添加誘導劑。然后采用優化后的培養基和發酵條件，在5 L和50 L發酵罐中，對該菌進行批次發酵和批次補料發酵實驗。最后確定變指數-恒pH法高密度發酵重組大腸桿菌，OD600達到97，海藻糖合成酶酶活達到(24 000±350) U/mL，實現了重組大腸桿菌高密度發酵生產海藻糖合成酶。