葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達及發酵條件優化

郭亞蘭，周雨朦，吳 斌，何冰芳

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800; 2.南京正大天晴制藥有限公司，江蘇南京222062；3.南京工業大學藥學院，江蘇南京211800)

木聚糖是除纖維素外含量最豐富的植物細胞壁多糖[1]。自然界中，絕大多數木聚糖結構復雜且具有高度分枝。因此，木聚糖的完全降解是一個復雜的過程，需要各種酶協同作用，包括β-1,4-內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、D-葡萄糖醛酸酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶等[2]。其中，β-1,4-內切木聚糖酶，通常定義為木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶。它能作用于木聚糖分子的主鏈骨架，將木聚糖水解為低聚木糖以及少量的木糖和阿拉伯糖[3]。

迄今為止，大多數的木聚糖酶屬于糖苷水解酶10家族(GH10)和11家族(GH11)[4]。然而，這些酶的活性受木聚糖取代基的數量和密度的影響。高取代的側鏈，如甲基葡萄糖醛酸(MeGA)和乙酰基等，破壞了GH10和GH11家族的木聚糖酶對主鏈的可及性，降低了酶水解木聚糖的能力。來自GH30家族的木聚糖酶能特異性地降解富含D-葡萄糖醛酸(GlcA)和甲基葡萄糖醛酸等側鏈殘基的木聚糖[5]，在硬木木聚糖等高側鏈取代的木聚糖降解中起到重要的補充作用。目前研究者已在歐文氏菌(Erwiniachrysanthe)[6]、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)[7]及類芽孢桿菌(Paenibacillusbarcinonensis)[8]等菌株中純化獲得了GH30的木聚糖酶。此外，許多GH10和GH11的木聚糖酶已在大腸桿菌[9]、枯草芽孢桿菌[10]和巴斯德畢赤酵母[11]中異源表達。枯草芽孢桿菌表達系統具有諸多優點，如非致病性、增加蛋白質可溶性表達、重組表達蛋白的內毒素低、更好的生物活性以及胞外分泌表達等[12-13]。然而目前還未見有GH30家族木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中表達的研究報道。

筆者所在課題組在前期研究中從枯草芽孢桿菌LC-9中篩選到一個葡萄糖醛酸木聚糖酶。本文中，筆者克隆葡萄糖醛酸木聚糖酶基因，并利用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pMA05在枯草芽孢桿菌WB800中進行該酶的異源表達，優化其表達條件，以期為該酶的應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisLC-9、大腸桿菌E.coliDH5α、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB800以及大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pMA05保存于何冰芳教授實驗室。

1.1.2 主要試劑

各種限制性內切酶、DNA聚合酶、DNA maker、標準蛋白，TaKaRa公司；溶菌酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒，Axygen公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖，Oxoid公司；Beechwood木聚糖、NaCl、Tris-base，市售分析純。

1.1.3 培養基

LB培養基[14](g/L)：蛋白胨 10.0、NaCl 10.0、酵母粉5.0；固體培養基中另加瓊脂20.0。

抗生素培養基：LB培養基滅菌后冷卻至60 ℃再加入過濾除菌的氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)使其終質量濃度分別為100 或50 mg/L。

1.2 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的DNA操作

質粒提取、DNA酶切、電泳、轉化等DNA操作參照文獻[14]進行。

1.3 葡萄糖醛酸木聚糖基因的克隆

根據實驗室前期所得序列設計PCR引物，其基因帶有自身信號肽。上下游引物的5′端分別設計了BamHⅠ、NdeⅠ酶切位點。上游引物BsXyn30-F：5′-A￣A￣A￣A￣G￣G￣A￣G￣C￣G￣A￣T￣T￣T￣A￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣A￣T￣T￣C￣C￣A￣C￣G￣C￣A￣T￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A-3′，下游引物BsXyn30-R：5′-G￣A￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣C￣T￣C￣T￣A￣G￣A￣G￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣T￣A￣A￣C￣G￣A￣T￣T￣T￣A￣C￣A￣A￣C￣A￣A￣A￣T￣G￣T￣T￣G￣T-3′。

以枯草芽孢桿菌LC-9為DNA模板，進行PCR擴增。PCR的反應體系為50 μL。其中，模板2 μL、上下游引物各2 μL、2×Priemix 25 μL、重蒸水19 μL。

反應條件：95 ℃預變形5 min后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行32個循環，72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物經DNA快速膠回收待用。

1.4 表達載體的構建

將pMA05質粒用BamHⅠ、NdeⅠ進行雙酶切，得到線性質粒與葡萄糖醛酸木聚糖酶基因，進行同源臂重組連接，之后轉入E.coliDH5α，菌落PCR驗證陽性克隆子。

1.5 葡萄糖醛酸木聚糖酶的發酵培養及表達

將質粒pMA05-BsXyn30轉入枯草芽孢桿菌WB800，得到重組菌WB800/pMA05-BsXyn30，加入含卡那霉素的LB種子培養基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養12 h。以2%(體積分數)的接種量接入LB發酵培養基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養36 h，室溫下8 000 r/min離心20 min后收集上清。

1.6 表達產物的分析鑒定

利用SDS-PAGE對收集的胞外上清液進行表達產物的分析，采用二硝基水楊酸(DNS)法[15]測葡萄糖醛酸木聚糖酶的酶活。取稀釋好的酶液0.5 mL加入到孵育好的1 mL 10 g/L的木聚糖中，在55 ℃下反應10 min后立即加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后在540 nm的波長下用分光光度計測相應吸光值。

葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活定義：每分鐘生成1 μmol還原糖所需酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.7 發酵條件優化

1)培養時間對菌株生長及產酶的影響。挑取單菌落，接入含卡那霉素的LB培養基中培養過夜，以2%的接種量接入液體LB培養基中進行發酵，在37 ℃、180 r/min搖床中培養。分別在3、6、9、12、24、36、48、60、72和84 h取樣，測定菌液OD600以及發酵上清液中的木聚糖酶酶活。

2)培養溫度對菌株生長及產酶的影響。將重組菌株接種于液體LB培養基中培養12 h(37 ℃、180 r/min)作為種子液，以2%接種量接種后分別于25、30、37和45 ℃中振蕩培養36 h后，對菌體的生長和產酶分別進行檢測。

3)培養基起始pH對菌株生長及產酶的影響。菌株經種子液培養，以2%接種量接種分別于初始pH為6.5、7.0、7.5和8.0的LB基礎培養基中，36 h后對菌體的生長和產酶分別進行檢測。

1.8 培養基碳源優化

1)碳源對菌株生長及產酶的影響。菌株經種子液培養，以2%接種量接種于LB培養基中，分別添加1%的麥芽糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇，36 h后檢測菌株的生長和產酶情況。

2)碳源濃度對菌株生長及產酶的影響。以2%接種量接種于LB培養基中，分別添加5、10、15、20、25和30 g/L的山梨醇，36 h后檢測菌株的生長和產酶情況。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖醛酸木聚糖酶基因克隆

從枯草芽孢桿菌LC-9中提取基因組總DNA，以此為模板，通過PCR擴增得到編碼葡萄糖醛酸木聚糖酶的基因，并進行分析，結果見圖1。由圖1可知，克隆條帶大小與理論基因的長度一致，說明成功從模板中擴增出該片段。將擴增得到的片段與pMD18-T vector連接，導入大腸桿菌中并送至測序公司測序。

圖1 葡萄糖醛酸木聚糖酶基因的PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification product of glucurono-xylanase gene

葡萄糖醛酸木聚糖酶的基因為1 266 bp，編碼 422個氨基酸，基因的開放閱讀框(ORF)含有信號肽及成熟肽序列。其中，成熟肽的基因序列為1 170 bp，編碼389個氨基酸(BsXyn30)。

BsXyn30與其他GH30家族木聚糖酶的多序列進行比對，結果見圖2。由圖2可知：BsXyn30與來自枯草芽孢桿菌168的XynC有99%的同源性[16]，與來自Bacillussp.strain BP-7的Xyn5B同源性為93%[17]，與來自P.barcinonensis的Xyn30D同源性為79%[8]。

2.2 重組工程菌的構建結果

2.2.1 質粒的構建結果

雙酶切質粒并與木聚糖酶基因片段進行同源臂重組連接，轉入大腸桿菌中得到重組質粒，經菌落PCR驗證，結果見圖3。由圖3可知，PCR擴增出來的片段與目的基因大小一致，表明重組質粒成功插入了大小約為1 200 bp的木聚糖酶基因片段。

圖2 序列比對結果Fig.2 Amino acid sequence alignment of BsXyn30 from B.subtilis LC9,XynC from Bacillus subtilis 168,Xyn5B from Bacillus sp.strain BP-7,Xyn30D from Paenibacillus barcinonensis

圖3 菌落PCR驗證Fig.3 Verification of colony PCR

圖4 重組酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinantglucurono-xylanase

2.2.2 葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達

將重組質粒化轉入枯草芽孢桿菌WB800，37 ℃發酵36 h后離心得到胞外上清液，進行酶活檢測以及SDS-PAGE電泳分析，結果見圖4。由圖4可知：木聚糖酶自身信號肽在枯草芽孢桿菌中可以正常發揮作用，其表達產物能有效分泌到胞外，通過DNS法[15]檢測胞外上清液的木聚糖酶活力可達14 U/mL，其表觀分子量為4.3×104。

2.3 葡萄糖醛酸木聚糖酶發酵條件的優化

2.3.1 發酵時間對產酶的影響

圖5為重組菌株的生長及產酶曲線。從圖5可以看出，在最開始的3 h細菌生長緩慢，之后生長速度加快進入對數期并在24 h達到生長的最高峰，之后進入衰亡期。前期培養基中營養豐富，細胞處于生長狀態，在后期發酵液中營養匱乏以及細菌產生的次級代謝產物使細菌生長受到抑制甚至死亡，造成總生物質大幅下降。

在葡萄糖醛酸木聚糖酶BsXyn30的產酶時間上，在對數前期酶活增長緩慢。到對數期后期以及穩定期前期酶活增長迅速，并在36 h時達到最高，之后緩慢下降。因為在穩定期前期，細菌生長速度開始下降，但細菌內部的質粒拷貝數仍然在迅速增長。在36 h菌液酶活達到最高值，為13.2 U/mL，而后酶活開始下降。接下來以此酶活為對照(100%)，進行發酵條件優化。

圖5 重組菌的生長與產酶曲線Fig.5 Growth curves and enzyme production ofrecombinant strain

2.3.2 發酵溫度對產酶的影響

考察溫度對重組菌株的產酶的影響，結果見圖6。由圖6可知：重組菌最佳生長溫度在37 ℃，并且在37 ℃具有最高的葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活。當溫度達到45 ℃，菌體量明顯下降導致酶活力降低，而且重組菌的最適生產溫度與大多數枯草芽孢桿菌的生長溫度一致[18-19]。

圖6 溫度對重組菌產酶的影響Fig.6 Effects of temperatures on enzymeproduction of recombinant strain

2.3.3 培養基起始pH對產酶的影響

考察pH對重組菌株的產酶的影響，結果如圖7所示。由圖7可知：在pH 6.5～8.0的范圍內，重組菌都能生長良好，在pH為7.5時重組菌生長得最好，酶活也最高，達到13.8 U/mL。總體來看，培養基起始pH在7.0～8.0的范圍內，葡萄糖醛酸木聚糖酶的表達都較好，而且酶活變化與菌體生長狀態一致，正常的培養基初始pH在7.4左右，故不需要調節pH。

圖7 初始 pH 對重組菌產酶的影響Fig.7 Effects of medium initial pH on enzymeproduction of recombinant strain

2.4 培養基碳源優化

碳源是微生物生長及產酶過程中非常重要的影響因子。考察不同碳源對重組菌生長及產酶的影響，結果如圖8所示。由圖8可知：碳源對重組菌的生長和產酶有重要影響，山梨醇作為碳源可以被重組菌很好地利用，酶活和菌體量都達到最大。其他碳源也可以被菌很好的利用，但相比而言，以山梨醇作為碳源時，菌體量最大，相對酶活也最高，為56.2 U/mL，約為普通LB培養下的3倍。而且周煌凱等[18]在研究木聚糖酶XynA在枯草芽孢桿菌中表達時發現，山梨醇是重組菌B.subtilisGJ148-XynA生長和產酶的最佳碳源。

圖8 碳源對重組菌產酶的影響Fig.8 Effects of carbon sources on enzymeproduction of recombinant strain

2.5 培養基碳源濃度的優化

碳源對菌株產酶及生長的影響非常大。因此，筆者進一步優化碳源濃度對菌株產酶及生長的影響，結果如圖9所示。由圖9可知：在5～20 g/L的碳源條件下，菌株的生長及產酶隨著碳源濃度的增加而增加，并在20 g/L時酶活及OD達到最高，酶活最高為76.0 U/mL，為優化前產酶的5.4倍。

圖9 碳源濃度對重組菌產酶的影響Fig.9 Effects of carbon sources concentration onenzyme production of recombinant strain

當碳源濃度過高時，菌株生長及產酶反而會下降。重組菌生長及產酶的最適碳源為20 g/L。在枯草芽孢桿菌中表達淀粉酶的研究發現，最適碳源為淀粉，添加量為20 g/L[20]。

3 結論

成功克隆了葡萄糖醛酸木聚糖酶基因，并構建了重組質粒，在枯草芽孢桿菌WB800實現了其高效表達。通過對重組菌的碳源及發酵條件優化，在37 ℃下重組菌發酵產酶，酶活最高可達76.0 U/mL，約為優化前產酶的5.4倍，表明達到了高效分泌表達。為今后葡萄糖醛酸木聚糖酶BsXyn30在食品、造紙以及飼料工業上的應用奠定了基礎。