Pgk和ilvN基因?qū)劝彼岚魲U菌產(chǎn)L-絲氨酸的影響

張 鑫，張曉梅，李 會，張曉娟，史勁松，許正宏

(1. 江南大學藥學院，江蘇無錫214122； 2. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

L-絲氨酸作為生產(chǎn)多種化學品和材料的最重要30個骨架化合物之一，是一種具有重要商業(yè)價值及多種用途的氨基酸，已廣泛應用于制藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[1]。目前L-絲氨酸的生產(chǎn)方法有化學合成法、蛋白水解法、生物酶法以及微生物發(fā)酵法，但化學合成法存在環(huán)境污染問題，蛋白水解法與生物酶法其成本較高，微生物發(fā)酵法因其具有成本低廉、環(huán)境污染小等優(yōu)勢受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注[2]。然而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的產(chǎn)量不高，無法工業(yè)化生產(chǎn)。谷氨酸棒桿菌是生產(chǎn)氨基酸最為重要的菌株[3]，利用其產(chǎn)L-絲氨酸成為了當前研究熱點。

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，對大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-絲氨酸的代謝工程改造取得了一定的進展。研究主要集中在增加L-絲氨酸合成途徑的碳流和減少降解途徑的碳流兩方面，以改造提高L-絲氨酸產(chǎn)量。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的L-絲氨酸代謝途徑如圖1所示。

加強表達目的基因；敲除目的基因圖1 谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-serinein C. glutamicum

蔗糖或葡萄糖等碳源進入胞內(nèi)，經(jīng)糖酵解反應得到重要底物3-磷酸甘油酸，然后經(jīng)過3步反應得到L-絲氨酸。3-磷酸甘油酸首先經(jīng)3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH，serA編碼)催化，再經(jīng)磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PSAT，serC編碼)與磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP，serB編碼)催化得到L-絲氨酸。L-絲氨酸在大腸桿菌中降解途徑與谷氨酸棒桿菌中降解途徑存在差異，在谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)通過L-絲氨酸脫水酶(L-serDH，sdaA編碼)降解為丙氨酸，而在大腸桿菌胞內(nèi)通過L-絲氨酸脫氨酶(sdaA、sdaB和tdcG編碼)降解為丙氨酸，兩者都通過絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT，glyA編碼)催化的反應降解為甘氨酸和C1單元。Mundhada等[4]首先敲除EscherichiacoliMG1655中編碼L-絲氨酸降解途徑關(guān)鍵酶的4個基因，并加強表達3個合成途徑關(guān)鍵酶基因與半胱氨酸轉(zhuǎn)運體構(gòu)建重組菌，通過補料分批補料發(fā)酵，積累12.6 g/L的L-絲氨酸。Stolz等[5]通過加強C.glutamicumATCC13032合成途徑基因的表達，敲除葉酸合成途徑中相關(guān)基因，并進一步敲除或者弱化降解途徑，L-絲氨酸產(chǎn)量可以達到36 g/L。以上改造策略表明增加L-絲氨酸合成途徑碳流，減少降解可以有效提高L-絲氨酸產(chǎn)量。

本課題組前期從土壤中篩選到一株可以直接利用糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-絲氨酸的野生型C.glutamicumSYPS-062[6]，再采用硫酸二乙酯(DES)對SYPS-062誘變得到高產(chǎn)菌株SYPS-062-33a，進一步解除L-絲氨酸對serA的反饋抑制，敲除降解基因sdaA得到菌株SYPS-062-33aΔSS，L-絲氨酸產(chǎn)量達到21.6 g/L[7]，同時發(fā)現(xiàn)重組菌副產(chǎn)物L-丙氨酸與L-纈氨酸較出發(fā)菌株有明顯提高。敲除L-絲氨酸到L-丙氨酸的轉(zhuǎn)氨酶(alaT和avtA編碼)，使副產(chǎn)物丙氨酸的含量由9.8 g/L下降至1.52 g/L；敲除了ilvN基因C末端的249 bp，弱化了L-纈氨酸合成途徑的乙酰羥酸合酶(ilvB和ilvN編碼)，使乙酰羥酸合酶酶活下降，得到重組菌ΔSSAAI，L-纈氨酸含量由6.54 g/L下降到2.63 g/L，ΔSSAAI L-絲氨酸產(chǎn)量達到26.23 g/L[8]；在此基礎(chǔ)上進一步通過常壓室溫等離子誘變(ARTP)得到高產(chǎn)菌株A36，L-絲氨酸產(chǎn)量提高為30.57 g/L，同時發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸產(chǎn)量也提高為3.11 g/L，L-丙氨酸產(chǎn)量為1.70 g/L，實驗結(jié)果表明L-纈氨酸仍然為主要副產(chǎn)物。本課題組前期采用弱化的方法改造了副產(chǎn)物L-纈氨酸途徑，L-纈氨酸的產(chǎn)量有一定程度下降，L-絲氨酸的產(chǎn)量得到一定提高。在此基礎(chǔ)上，筆者期望通過敲除L-纈氨酸的合成途徑進一步減少副產(chǎn)物L-纈氨酸的積累以提高L-絲氨酸的產(chǎn)量。目前針對糖酵解途徑(pgk)的改造，增加L-絲氨酸合成途徑的碳流來提高L-絲氨酸產(chǎn)量的策略未見報道。

本文中，筆者擬通過加強表達磷酸甘油酸激酶(pgk)，增加L-絲氨酸的前體物質(zhì)3-磷酸甘油酸供應，敲除L-纈氨酸合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因ilvN，使碳流流向L-絲氨酸合成途徑，提高L-絲氨酸的產(chǎn)量[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物

C.glutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI(縮寫為ΔSSAAI)，C.glutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI-A36(縮寫為A36)為研究室成員前期構(gòu)建并保藏；大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達質(zhì)粒pDXW-10為王小元教授實驗室饋贈[11]；大腸桿菌JM109、谷氨酸棒桿菌敲除質(zhì)粒pK18mobsacB保存于筆者所在實驗室[12]；重組質(zhì)粒pDXW-10-pgk和pk18mobsacB-ΔilvN為筆者自行構(gòu)建。實驗涉及引物見表1。

表1 文中所用到的主要引物

注：酶切位點用下劃線標出。

1.1.2 試劑

蔗糖、(NH4)2SO4、NaCl等常用分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司；腦心浸液(BHI)、原兒茶酸等，Sigma公司；硫酸卡那霉素、生物素和鹽酸硫胺素，上海生工生物工程有限公司；DNA分子操作相關(guān)試劑盒，上海捷瑞生物工程公司；高保真酶、限制性內(nèi)切酶等相關(guān)工具酶，寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10 (固體培養(yǎng)基再瓊脂粉 20)。滅菌條件為121 ℃、20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液 37、葡萄糖 20、(NH4)2SO410、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO40.2、NaH2PO40.3。滅菌條件為115 ℃、7 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100、(NH4)2SO430、 KH2PO43、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.02、MnSO4·H2O 0.02、原兒茶酸0.03、生物素 5×10-5、鹽酸硫胺素 4.5×10-4、CaCO360。滅菌條件為115 ℃、7 min。

谷氨酸棒桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10、吐溫80 1、甘氨酸 25、異煙肼 0.04。滅菌條件為121 ℃、20 min。

谷氨酸棒桿菌電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 5、山梨醇 91、腦心浸液 18.5、瓊脂粉 20。滅菌條件為121 ℃、20 min。

10%蔗糖篩選培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液 37、蔗糖 100、(NH4)2SO410、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO40.2、NaH2PO40.3、瓊脂粉 20。滅菌條件為115 ℃、7 min。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸棒桿菌的活化及發(fā)酵

將保藏的谷氨酸棒桿菌菌液取出，置于冰上融化，于固體種子培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，然后挑取單菌落在平板上劃線，再培養(yǎng)3 d，使菌株活力得到充分恢復。接種于20 mL種子培養(yǎng)基中(根據(jù)需要加入相應的抗生素，100 mg/L)，在30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h。待種子OD562達到25左右時，將1 mL種子液接種到25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)120 h，根據(jù)需要每間隔12 h進行取樣。

1.2.2 加強表達pgk基因

過表達質(zhì)粒的構(gòu)建：以谷氨酸棒桿菌A36基因組為模板，利用引物pgk-F/pgk-R擴增基因pgk，將目的基因片段和質(zhì)粒pDXW-10用EcoRⅠ、HindⅢ進行雙酶切，利用T4 DNA ligase連接，得到重組質(zhì)粒pDXW-10-pgk。

過表達重組菌的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒pDXW-10-pgk電轉(zhuǎn)至C.glutamicumA36感受態(tài)中， 30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，挑取平板上的單菌落接種到液體種子培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒進行雙酶切與測序驗證。若都正確，則表明重組菌構(gòu)建成功。

1.2.3ilvN基因的敲除

敲除質(zhì)粒的構(gòu)建：以谷氨酸棒桿菌A36基因組為模板，ilvN-1/ilvN-2、ilvN-3/ilvN-4為引物，經(jīng)過PCR反應得到ilvN基因上下游同源臂片段。然后以上下游同源臂片段為模板利用引物ilvN-1和ilvN-4再次PCR，得到ilvN基因截短的片段。質(zhì)粒pk18mobsacB和基因截短的片段用EcoRⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，然后用T4 DNA ligase酶進行連接，得到敲除質(zhì)粒pk18mobsacB-ΔilvN。

敲除菌株的構(gòu)建：將敲除質(zhì)粒pK18mobsacB電轉(zhuǎn)至C.glutamicumA36感受態(tài)中，挑取一次重組長出的單菌落接種至抗性液體種子培養(yǎng)基中，待其達到對數(shù)生長期后，稀釋102～103倍涂布于10%蔗糖篩選平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。再次挑取二次重組長出的單菌落至液體種子培養(yǎng)基中，利用引物ilvN-1和ilvN-4進行PCR與測序驗證。若都正確，則表明重組菌構(gòu)建成功。

1.2.4 添加不同濃度L-纈氨酸對出發(fā)菌株A36及ilvN基因敲除菌株發(fā)酵的影響

ilvN基因的缺失會影響菌株L-纈氨酸的合成，對菌株的生長可能產(chǎn)生影響，為維持菌株正常生長，向培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度分別為250、500、750和1 000 mg/L的L-纈氨酸，考察其對出發(fā)菌株及重組菌株發(fā)酵的影響。

1.2.5 發(fā)酵參數(shù)的測定

生物量的測定：發(fā)酵液用1 mol/L HCl稀釋適當倍數(shù)，紫外分光光度計測定OD562。

發(fā)酵液中氨基酸及殘?zhí)菨舛鹊臏y定：采用HPLC法測定發(fā)酵液中氨基酸產(chǎn)量及殘?zhí)呛縖7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建

2.1.1 過表達質(zhì)粒及重組菌株的構(gòu)建

以高產(chǎn)菌株A36基因組為模板，利用引物對pgk-F/pgk-R進行PCR反應，得到pgk片段為1 218 bp，將該片段經(jīng)雙酶切后與pDXW-10質(zhì)粒相連接，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證；然后進行重組菌株A36-pDXW-10-pgk的構(gòu)建，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至A36感受態(tài)中，提取質(zhì)粒雙酶切驗證，驗證結(jié)果如圖2(a)所示。由圖2(a)可知：質(zhì)粒pDXW-10條帶大小為8 300 bp左右，pgk基因條帶大小約為1 200 bp，表明重組菌A36-pDXW-10-pgk構(gòu)建成功。

2.1.2 敲除質(zhì)粒及重組菌株的構(gòu)建

以高產(chǎn)菌株A36基因組為模板，利用引物ilvN-1/ilvN-2、ilvN-3/ilvN-4進行PCR反應，得到上下游片段為531 bp。然后以上下游片段為模板，利用引物ilvN-1和ilvN-4進行融合PCR，得到含有同源臂片段的ilvN敲除的基因片段，約1 000 bp。將該片段經(jīng)雙酶切后連接到敲除質(zhì)粒pk18mobsacB，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109，然后提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，并送至測序公司進行測序，經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pk18mobsacB-ΔilvN構(gòu)建成功。然后進行重組菌株的構(gòu)建，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至A36感受態(tài)中，在Kan抗性平板上進行一次重組，然后挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)涂布于10%蔗糖的篩選平板進行二次重組，挑取轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，如圖2(b)所示。由圖2(b)可知：出發(fā)菌株的條帶大小為1 500 bp左右，敲除重組菌的條帶大小為1 000 bp左右，表明重組菌株A36ΔilvN構(gòu)建成功。

M—標準DNA；1—EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切片段M′—標準DNA；1′、2—出發(fā)菌株；3、4—敲除重組菌圖2 重組菌株的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant strain

2.2 重組菌株的發(fā)酵

2.2.1 重組菌A36-pDXW-10-pgk的發(fā)酵性狀分析

通過加強表達糖酵解途徑的基因pgk，期望增加L-絲氨酸前體物質(zhì)3-磷酸甘油酸的積累，使更多的碳流進入L-絲氨酸合成途徑。重組菌A36-pDXW-10-pgk與A36進行發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，菌株的糖耗以及產(chǎn)酸基本無差異，但生長稍有增加。結(jié)果表明加強表達基因pgk對A36發(fā)酵性能沒有顯著影響，可能是因為pgk催化1,3-二磷酸甘油酸生成的3-磷酸甘油酸既可能流向L-絲氨酸合成途徑也可能流向TCA循環(huán)(圖1)，該節(jié)點流量雖有增加，流向TCA循環(huán)導致菌株生長稍有提高，而L-絲氨酸產(chǎn)量變化不大。

A36-pDXW-10-pgk：ρ(殘?zhí)?(△)、OD562(□)、ρ(L-絲氨酸)(○)；A36：ρ(殘?zhí)?(▲)、OD562(■)、ρ(L-絲氨酸)(●)圖3 A36-pDXW-10-pgk和A36發(fā)酵表型分析Fig.3 Fermentation profiles of strain A36-pDXW-10-pgkand A36

2.2.2 重組菌A36ΔilvN的發(fā)酵性狀分析

考察敲除L-纈氨酸途徑關(guān)鍵酶對重組菌株A36發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出：敲除菌株A36ΔilvN的L-纈氨酸產(chǎn)量大幅度下降，只積累0.4 g/L L-纈氨酸。與A36相比，其L-纈氨酸產(chǎn)量下降了87%，L-絲氨酸的產(chǎn)量為24.96 g/L，反而下降了18.3%，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.25 g/g，下降了16.7%。在前60 h重組菌基本不積累L-纈氨酸，重組菌生長也受到明顯抑制，在60 h后L-纈氨酸開始逐漸積累，使重組菌的生長得以恢復，最終重組菌最大OD562達到49.92，說明在菌株A36中敲除ilvN基因，菌株雖然沒有形成營養(yǎng)缺陷型菌株，但會導致菌株出現(xiàn)生長延遲現(xiàn)象。當L-纈氨酸開始積累時，L-絲氨酸也開始積累，表明L-纈氨酸的添加恢復了菌株生長和L-絲氨酸的積累。

A36ΔilvN:ρ(殘?zhí)?(△)、OD562(□)、ρ(L-絲氨酸)(○)、ρ(L-纈氨酸)(◇)；A36:ρ(殘?zhí)?(▲)、OD562(■)、ρ(L-絲氨酸)(●)、ρ(L-纈氨酸)(◆)圖4 A36ΔilvN和A36發(fā)酵表型分析Fig.4 Fermentation profiles of strain A36ΔilvN and A36

2.3 添加不同濃度L-纈氨酸對出發(fā)菌及重組菌發(fā)酵的影響結(jié)果

菌株前期生長受到抑制，添加一定濃度L-纈氨酸(Val)可能有助于菌株的生長與產(chǎn)酸。因此，考察添加不同濃度L-纈氨酸對出發(fā)菌A36及重組菌株A36ΔilvN生長和產(chǎn)酸的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在添加不同L-纈氨酸后出發(fā)菌株A36的L-絲氨酸產(chǎn)量與生長基本無變化，外源添加的L-纈氨酸并未被菌株A36利用，表明菌株A36自身生成的L-纈氨酸滿足自身生長與產(chǎn)酸需求，不需要外源L-纈氨酸的添加。但由圖5(c)可知，發(fā)酵培養(yǎng)基添加了不同濃度L-纈氨酸后，菌株A36ΔilvN的生長得到了恢復，L-絲氨酸產(chǎn)量也有提高。添加不同濃度L-纈氨酸條件下，A36ΔilvN與出發(fā)菌株A36的發(fā)酵性能見表2。

由表2可知，在添加250 mg/L L-纈氨酸時，L-絲氨酸產(chǎn)量為31.22 g/L，最大OD562為61.5，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.31 g/g，相比添加前分別提高了25%、23.2%和24%。當L-纈氨酸質(zhì)量濃度分別提高到500與750 mg/L時，L-絲氨酸產(chǎn)量與OD562均有較大的提高，分別可積累32.01與34.19 g/L的L-絲氨酸。與A36ΔilvN分別提高28.2%與37%相比，糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高28%與36%。當L-纈氨酸質(zhì)量濃度進一步提高到1 000 mg/L時，L-絲氨酸產(chǎn)量與添加量在750 mg/L時相比，反而有所下降，L-絲氨酸積累僅32.23 g/L，表明此時菌株的生長與產(chǎn)酸不需要過量的L-纈氨酸。從圖5 (d)中可知，當添加不同濃度的L-纈氨酸時，發(fā)酵液中的L-纈氨酸的積累量也在不斷增加，但L-纈氨酸的積累量均小于出發(fā)菌株A36中的積累。在添加量為750 mg/L時，L-纈氨酸積累量僅為1.42 g/L，相比出發(fā)菌株A36下降54.3%。

A36—不加纈氨酸的原始菌對照；A36ΔilvN—不加纈氨酸的重組菌對照圖5 L-纈氨酸添加對A36及A36ΔilvN發(fā)酵性能的影響Fig.5 Effects of L-valine concentration on fermentation performance

表2 添加L-纈氨酸條件下A36ΔilvN與出發(fā)菌株A36的發(fā)酵性能

Table 2 Fermentation performance of A36ΔilvNunder different concentrations of L-valine and the control strain A36

ρ(L纈氨酸)/(mg·L-1)OD562ρ(L絲氨酸)/(g·L-1)ρ(L纈氨酸)/(g·L-1)YL絲氨酸/(g·g-1)PL絲氨酸/(g·L-1·h-1)A36(0)58.92±1.6330.57±0.783.11±0.170.300.25A36ΔilvN(0)49.92±1.7824.96±1.080.40±0.100.250.2125061.51±1.4631.22±0.290.82±0.220.310.2650063.50±1.8932.01±0.521.19±0.300.320.2775065.20±1.7534.19±0.681.42±0.240.340.281 00064.45±1.0432.23±0.371.86±0.360.320.27

注：YL-絲氨酸表示L-絲氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率；PL-絲氨酸表示L-絲氨酸生產(chǎn)強度。

3 結(jié)論

為進一步提高L-絲氨酸的產(chǎn)量，以高產(chǎn)菌株A36為出發(fā)菌株，首先采取過表達磷酸甘油酸激酶，增加L-絲氨酸合成途徑碳流的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pgk對菌株A36的產(chǎn)酸無顯著影響，可能是因該節(jié)點既可能流向L-絲氨酸合成途徑也可能流向TCA循環(huán)，該點流量雖有增加，流向TCA循環(huán)導致菌株生長稍有提高，而L-絲氨酸產(chǎn)量變化不大。進一步對L-纈氨酸合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因ilvN進行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌株前期不積累L-纈氨酸，菌株的生長受到限制。但在發(fā)酵的中后期，L-纈氨酸開始少量積累，此時菌株開始快速生長，L-絲氨酸也開始大量積累。進一步在培養(yǎng)基中添加不同濃度L-纈氨酸，發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸添加量為750 mg/L時， L-絲氨酸產(chǎn)量達到34.19 g/L，OD562為65.2，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.34 g/g，生產(chǎn)強度為0.28 g/(L·h)，相比出發(fā)菌株A36分別提高了11.8%、10.6%、13.3%和12.0%。L-纈氨酸積累量為1.41 g/L，相比出發(fā)菌株下降了54.3%,表明適量L-纈氨酸的存在有助于菌株的生長與L-絲氨酸的積累。