中國野生毛葡萄芪合成酶基因表達與抗白粉病分析

劉夢琦，吳鳳穎，王躍進

（西北農林科技大學園藝學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室/農業部西北地區園藝作物生物與種質創制重點實驗室，陜西楊凌 712100）

0 引言

【研究意義】葡萄是一種具有重要經濟價值的世界性水果[1-2]。據 2017年世界糧農組織 FAO（http://www.fao.org/home/zh/）數據統計，葡萄全球種植面積達693.14萬公頃，產量達7 427.66萬噸。歐洲葡萄（Vitis vinifera）是栽培葡萄最重要的一個種，因產量高、果實品質佳，被廣泛用于鮮食或釀酒，但其對真菌性病害抗病性較弱，尤其是白粉病，可造成其產量下降，品質受損[1,3-4]。由于歐洲葡萄基因高度雜合，通過雜交育種提高歐洲葡萄抗病性易導致雜交后代性狀分離、品質下降[5]，嚴重制約著歐洲葡萄的品質及產量。而使用化學農藥則容易使病原菌產生抗性或變異形成新的病害，并對環境有一定影響。定性改良歐洲葡萄的抗病能力，選育抗病新品種已成為葡萄育種的重要目標之一[6]。中國野生葡萄具有良好的生物及非生物抗性，為葡萄育種提供了優質的種質資源[3]。中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’（V.quinquangularisaccession Danfeng-2）對白粉病具有較強的抗性[7]，且白藜蘆醇（resveratrol）含量較高[8]。研究中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’及其攜帶的芪合成酶（stilbene systhase，STS）基因的作用，可為定向改良歐洲葡萄品種白粉病抗性與增加芪類物質含量提供種質資源與基因資源，對抗病育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】白藜蘆醇不僅作為植保素在植物防御反應中發揮著重要作用[9]，而且在人類抗腫瘤、抗氧化等方面具有重要的醫療保健功能[10-11]。芪合成酶是白藜蘆醇合成途徑的關鍵酶[12-13]。1981年，HART[14]首次報道芪合成酶催化合成芪類物質，是具有抑制真菌活性的次級代謝產物。PARAGE等[15]分析了葡萄芪合成酶家族基因的分子進化、結構與功能，表明芪合成酶家族基因具有多樣性，可以編碼具有活性的蛋白。目前，已經在煙草[16-17]、水稻[18]、番茄[19]、擬南芥[20]、蘋果[21]等多個物種中對遺傳轉化STS進行了研究，表明異源轉化STS可以提高植株抗病性，同時在轉化植株中可以檢測到芪類物質的合成。在葡萄中，課題組前期已通過農桿菌轉化法獲得了VpSTS29轉基因無核白、VpSTS29轉基因霞多麗、VqSTS6轉基因無核白[22-23]。芪合成酶家族基因不同成員在葡萄中的表達具有時空特異性，VANNOZZI等[24]對歐洲葡萄黑比諾不同發育時期、生物與非生物脅迫條件下芪合成酶家族基因進行了表達分析，發現VvSTS不同成員表達模式不同；SHI等[25]研究發現，中國野生毛葡萄STS（VqSTS）的表達存在組織特異性，且不同VqSTS對白粉病菌（Uncinula necator）的響應程度不同。【本研究切入點】利用同源克隆技術，對課題組前期獲得的中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’41個STS，選擇在果實中表達較高的VqSTS26與幼葉中表達較高的VqSTS32[25]進行克隆分離，利用農桿菌介導的遺傳轉化技術，將VqSTS26、VqSTS32轉至歐洲葡萄無核白（V.viniferacv.Thompson Seedless）品種，并分析轉基因無核白與野生型無核白STS表達、產物量及對白粉病抗性的差異?！緮M解決的關鍵問題】通過農桿菌介導法獲得穩定轉化VqSTS26、VqSTS32的葡萄植株，分析比較VqSTS26、VqSTS32轉基因植株在人工接種白粉病菌前后STS表達及其產物芪類物質積累的差異，并對轉基因植株進行抗病性分析，探索STS表達在葡萄抗白粉病中發揮的作用，以期獲得既抗白粉病同時芪類物質含量高的葡萄新種質。

1 材料與方法

試驗于2016年12月至2018年12月在西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室和西北農林科技大學園藝學院葡萄種質資源圃完成。

1.1 材料

中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’和歐洲葡萄品種無核白定植于西北農林科技大學園藝學院葡萄種質資源圃。轉基因受體材料歐洲葡萄品種無核白組培苗培養于西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室人工氣候室。

研究所用pGEM-T-easy購自TaKaRa公司，E.coliTop10購自北京天根公司，農桿菌GV3101菌株為本實驗室保存。

1.2 VqSTS26與VqSTS32的生物信息學分析

利用 NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’的VqSTS26（JQ868666）、VqSTS32（JQ868672）基因序列，比對至歐洲葡萄基因組網站（http://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Info/Index）下載同源序列并使用MEGA7.0中的Clustal W進行序列比對；聚類分析所用序列信息來自于 NCBI與歐洲葡萄基因組網站，采用 maximum likelihood（ML）法，bootstrap值設為1 000。

1.3 基因克隆與植物表達載體構建

參照 E.Z.N.A Plant RNA Kit試劑盒（Omega R6827）說明書方法提取中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’葉片 RNA，cDNA反轉錄參照 FastKing RT Kit（With gDNase）試劑盒（天根KR116）說明書。以毛葡萄‘丹鳳-2’葉片 cDNA為模板，分別以對應VvSTS序列為依據設計引物（表1），5′部分添加SacI酶切位點序列，3′反向互補部分添加XbaI酶切位點序列，通過同源重組進行基因克隆并構建包含從毛葡萄擴增出的目的STS與GFP融合的植物穩定表達載體pCAMBIA35S::VqSTSs:: GFP。

用于克隆的載體為pGEM-T-easy，克隆菌株為大腸桿菌感受態細胞E.coliTop10，植物表達載體為pCAMBIA2300，用于植物遺傳轉化的農桿菌菌株為GV3101。

1.4 器官發生途徑遺傳轉化

以無核白單芽莖段為材料，通過器官發生途徑誘導分生愈傷組織用于農桿菌介導的遺傳轉化。步驟如下：農桿菌二次活化（28℃，150 r/min），5 000 r/min離心并用MS液體培養基（含20 mg·L-1乙酰丁香酮和3%的蔗糖）重懸，培養3—4 h（28℃，150 r/min），使菌液濃度達到OD600=0.8，用于轉化。分生愈傷切成0.5 cm3的塊狀，農桿菌重懸液中侵染15 min，于共培養培養基（IM3+100 μmol·L-1AS，pH 5.8）上培養 2 d（25℃，暗培養）后，用1/2 MS液體培養基（含有800 mg·L-1Cef和 800 mg·L-1Carb）脫菌 2 次，每次 10—15 min，無菌水沖洗 2—3次，轉至篩選培養基上（ IM3+75 mg·L-1Kan+300 mg·L-1Cef+200 mg·L-1Carb，pH 5.8）培養（25℃，光照培養），每月繼代一次?？剐杂鷤ㄟ^器官再生途徑再次誘導成苗，具體方法參照XIE等[26]。

1.5 轉基因植株的分子鑒定

葡萄葉片的gDNA采用CTAB法提取，用于PCR檢測的特異性引物如表1所示。取轉基因植株的葉片用于Western blot檢測。蛋白提取參考鮑睿[27]的方法：取待測樣品0.5 g，液氮中充分研磨，加入250 μL蛋白裂解液充分渦旋，冰敷15 min，4℃ 12 000×g離心15 min，取上清并加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻至室溫，10 000×g離心3 min，用于SDS-PAGE。

參照HEART SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書制作SDS-PAGE膠；用半干轉膜法在PVDF膜（羅氏3010040001）上印跡；用抗GFP標簽鼠單克隆抗體（全式金HT201）與HRP-羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（全式金HS201）進行免疫檢測；顯色試劑盒為PierceTMECL Western Blotting Substrate（Thermo 32109）。

1.6 VqSTS26和VqSTS32轉基因株系的白粉病抗性分析

1.6.1 葡萄白粉病菌接種處理 白粉病菌取自西北農林科技大學園藝學院葡萄種質資源圃易感病的歐洲葡萄葉片，采用壓片法接種于培養在人工氣候培養箱的野生型歐洲葡萄葉片上繼續培養，用于后期的葡萄白粉病菌接種處理。采用壓片法將感病葡萄葉片上的白粉病菌接種于移栽煉苗 8周后的待接菌植株上[7]。接種時，選擇莖尖的第3—4片充分展開且生長良好的葉片進行接種。

1.6.2 葡萄葉片上白粉病菌菌絲生長過程的顯微觀察 通過染色[28]對接菌后的葡萄葉片進行顯微觀察，具體方法：將樣品剪成1 cm×2 cm長條置于10 mL離心管中，加入3 mL臺盼藍染液，沸水浴10 min后避光條件下過夜染色，水合氯醛脫色兩次（過夜一次），于熒光顯微鏡下觀察白粉病菌的生長情況，統計接菌1、2、3和7 dpi葡萄葉片白粉病菌孢子萌發、初級菌絲、次級菌絲及分生孢子梗形成數，3次生物學重復。

1.6.3 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR） 取接菌后 0—7 dpi葡萄葉片，參照1.3的方法提取cDNA，作為qRT-PCR分析的模板，以VvGAPDH為內參基因，用于qRT-PCR的引物設計參照CHENG等[23,25]。qRT-PCR分析采用三步法，參照 NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus說明書（Novoprotein E096）。3次生物學重復，每個重復3次技術重復。

1.6.4 液相色譜分析 取接菌0、7 dpi葡萄葉片進行高效液相色譜分析（HPLC），方法參照ZHOU等[8]，通過標準曲線上的保留時間確定樣品中的目標物質，通過標準峰面積和樣品峰面積的比值計算樣品中芪類物質的含量，3次生物學重復。

1.7 芪合成酶代謝相關基因表達分析

取轉基因與野生型無核白葡萄葉片，對芪合成酶代謝途徑中的VqSTS及5個相關基因包括VqSTS相關的轉錄因子MYB14和MYB15、上游苯丙氨酸脫氨酶基因（PAL）、下游糖基轉移酶基因（RSGT）以及與芪合成酶存在底物競爭關系的查爾酮合成酶基因（CHS）進行 qRT-PCR分析，方法參照 1.6.3，引物設計參照 CHENG等[23,25]。3次生物學重復，每個重復進行3次技術重復。

1.8 數據分析

數據表示為平均數±標準差（SD），n=3。顯著性分析通過SPSS23.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）統計軟件，采用One-way ANOVA分析的LSD法和Tukey法。

2 結果

2.1 VqSTS26、VqSTS32定位與序列分析

圖1 ‘丹鳳-2’VqSTS26、VqSTS32的定位、序列比對及聚類分析Fig.1 Localization, sequence alignment and cluster analysis of VqSTS26 and VqSTS32 from ‘Danfeng-2’

序列分析得出VqSTS26和VqSTS32的編碼序列全長為1 179 bp，編碼392個氨基酸，分子量大小為43 kD。以歐洲葡萄基因組V.viniferacv.Pinot Noir clone P40024為依據，對中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’的VqSTS26、VqSTS32進行序列比對，VqSTS26定位于16號染色體反向16 710 281—16 711 809位置（圖1-A），對應歐洲葡萄的位點基因是VvSTS48，兩者存在5個位點的氨基酸不同，存在差異的氨基酸位點在VqSTS26中從N端至C端依次為苯丙氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、甘氨酸和異亮氨酸，在VvSTS48中依次為絲氨酸、纈氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和纈氨酸；VqSTS32位于16號染色體正向16 335 707—16 337 233位置（圖1-A），對應歐洲葡萄的位點基因是VvSTS15，兩者存在3個不同的氨基酸位點，分別為VqSTS32位于N端的亮氨酸和纈氨酸不同于VvSTS15位于N端的絲氨酸和異亮氨酸，以及VqSTS32位于C端的天冬氨酸不同于VvSTS15位于N端的谷氨酸（圖1-B）。對不同植物的STS進行聚類分析，發現VqSTS26、VqSTS32分別與歐洲葡萄中的VvSTS48、VvSTS15相似度最高，分別為 98.72%和 99.23%；其次是高粱（Sorghum bicolor）和花生（Arachis hypogaea），分別為87.94%和87.93%（圖1-C）。

2.2 VqSTS26、VqSTS32克隆、遺傳轉化與轉基因植株的鑒定

以毛葡萄‘丹鳳-2’葉片cDNA為模板，通過同源克隆獲得VqSTS26、VqSTS32并構建至植物過表達載體pCAMBIA2300-GFP，隨后轉入GV3101農桿菌中并經過菌液PCR驗證（圖2-A）；以誘導的分生愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料，進行農桿菌介導的遺傳轉化（圖2-B）；獲得PCR檢測與Western blot檢測均為陽性的轉基因植株共13株，其中轉VqSTS26無核白株系8株；轉VqSTS32無核白株系5株（圖2-C）。

2.3 轉基因株系白粉病抗性分析

2.3.1 轉基因株系白粉病菌發育進程的顯微觀察與

統計 為了研究轉基因株系的白粉病抗性，選擇Western blot鑒定蛋白印跡較明顯的OEVqSTS26-L6、OEVqSTS26-L8兩個VqSTS26轉基因株系和OEVqSTS32-L3、OEVqSTS32-L4兩個VqSTS32轉基因株系，以野生型無核白為對照，進行白粉病菌接種試驗（圖3-A）。通過顯微觀察（圖3-B），統計葡萄葉片接菌1、2、3和7 dpi每100個孢子的萌發數、初級菌絲與次級菌絲的生長數，以及接菌3和7 dpi的每100個孢子分生孢子梗的形成個數，結果表明轉基因株系可以抑制白粉病菌的發育進程（表2），具體表現在株系OEVqSTS26-L6和株系OEVqSTS26-L8在接菌1 dpi幾乎未觀察到次級菌絲的生成，而野生型在1 dpi已經開始形成次級菌絲，轉基因株系次級菌絲生長率在接菌2 dpi和3 dpi均顯著低于野生型無核白；轉基因株系在接菌3 dpi未觀察到分生孢子梗的形成，而野生型無核白于接菌3 dpi已經開始形成分生孢子梗。

2.3.2 轉基因植株人工接種白粉病菌后STS及其產物表達分析 為了研究轉基因與野生型無核白在人工接種白粉病菌前后STS表達的動態變化，對接菌0—7 dpi轉基因與野生型無核白STS表達量進行qRT-PCR分析（圖4-A、4-B）。結果表明白粉病菌誘導后STS表達上調且轉基因株系STS表達量均高于野生型無核白?？傮w趨勢為STS表達量在接菌1 dpi時顯著升高，隨之在2—6 dpi輕微波動，最后在7 dpi達最高值。其中，OEVqSTS26-L6轉基因株系在接菌1、4、5和7 dpiSTS表達量極顯著高于野生型；OEVqSTS26-L8轉基因株系STS表達量在接菌1—5和7 dpi極顯著高于野生型；OEVqSTS32-L3轉基因株系在接菌3、6 dpiSTS表達量顯著高于野生型，在0、2、4和5 dpi極顯著高于野生型；OEVqSTS32-L4轉基因株系在接菌1、2、4和7 dpiSTS表達量極顯著高于野生型。接菌 7 dpi時，OEVqSTS26-L6和OEVqSTS26-L8轉基因株系STS表達量分別是同時期野生型無核白的26倍和29倍；OEVqSTS32-L3和OEVqSTS32-L4轉基因株系STS表達量分別是同時期野生型無核白的 7倍和 12倍。不同的是OEVqSTS32-L3轉基因株系接菌后STS表達量的明顯上調出現在接菌2 dpi。

表2 葡萄葉片每100個孢子萌發數、初級菌絲數、次級菌絲數和分生孢子梗數統計Table2 Amounts of germination, primary hyphae, secondary hyphae and conidiophore of per 100 spores of grape leaves

圖2 轉VqSTS26、VqSTS32無核白的遺傳轉化過程與轉基因植株的鑒定Fig.2 Transformation and identification of transgenic VqSTS26 and VqSTS32 Thompson Seedless mutant plants

圖3 轉基因植株葡萄白粉病抗性分析Fig.3 Analysis of the resistance to powdery mildew in transgenic VqSTS26 and VqSTS32 plants

圖4 人工接種白粉病菌后轉基因植株與野生型無核白STS表達及芪類物質含量分析Fig.4 Analysis of STS expression and stilbenoids content between transgenic plants and wild-type Thompson Seedless after U.necator induction

進一步分析接菌前后芪類物質含量的變化，對接菌0、7 dpi的轉基因與野生型無核白進行HPLC分析（圖4-C、4-D）。結果表明接菌0 dpi時，在葡萄中主要檢測到的芪類物質為糖苷且轉基因株系的糖苷含量極顯著高于野生型無核白，白藜蘆醇僅在轉基因株系中檢測到。接菌7 dpi時，在轉基因株系中可以檢測到糖苷、白藜蘆醇和葡萄素3種芪類物質，而在野生型無核白中未檢測到葡萄素，且轉基因株系中糖苷與白藜蘆醇的含量均極顯著高于野生型無核白。接菌后葡萄葉片白藜蘆醇和葡萄素的含量相較于接菌前均有所提高。接菌 7 dpi時OEVqSTS26-L6株系葡萄素含量最高，為12.71 μg·g-1DW；OEVqSTS26-L8株系白藜蘆醇和糖苷含量最高，分別為24.62和4 256.86 μg·g-1DW，是該株系接菌前的4.4倍和1.4倍，相較于接菌7 dpi的野生型無核白分別提高了2.5倍和3.8倍。

2.4 轉基因植株芪合成酶代謝相關基因表達分析

圖5 轉基因植株芪合成酶代謝相關基因表達的qRT-PCR分析Fig.5 qRT-PCR analysis of STS metabolic pathway related gene expression in transgenic lines

為研究轉基因植株芪合成酶代謝相關基因的表達變化，對獲得的13個轉基因株系進行qRT-PCR分析，包括轉入的芪合成酶基因VqSTS26和VqSTS32以及與STS相關的轉錄因子MYB14和MYB15、上游苯丙氨酸脫氨酶基因（PAL）、下游糖基轉移酶基因（RSGT）、與芪合成酶存在底物競爭關系的查爾酮合成酶基因（CHS）（圖5）。結果表明，VqSTS26與VqSTS32表達量分別在相應轉基因株系中上調，上調水平極顯著的是 OEVqSTS26-L3、OEVqSTS26-L4、OEVqSTS26-L6和OEVqSTS32-L4株系。其中OEVqSTS26-L6和OEVqSTS32-L4株系相較于野生型分別提高了17倍和13倍。RSGT和PAL上調表達[29]，其中RSGT的表達量在OEVqSTS26-L8、OEVqSTS32-L3和OEVqSTS32-L4中分別提高了13、9和9倍，大多數轉基因植株中PAL的表達量上調，僅OEVqSTS26-L7和OEVqSTS26-L2株系PAL的表達量輕微下調。CHS與STS存在底物競爭關系[30]，其表達量下調。MYB14與MYB15表達量無顯著變化。

3 討論

葡萄是國內外公認的最重要的經濟作物和廣泛栽培的水果種類之一。FAO 2017年數據顯示，葡萄種植面積居世界水果種植面積首位。在中國，葡萄種植面積為77.86萬公頃，占世界葡萄總種植面積的11.23%，位居世界第二位。白粉病是葡萄栽培面臨的世界范圍的災難性病害[31]。葡萄抗病基因的發掘及抗病育種在葡萄生產中具有不可取代的重要意義。研究表明葡萄對白粉病的抗性與芪合成酶（STS）的積累有關[32]。本研究中，接菌處理后STS表達上調，轉基因植株STS表達量顯著高于野生型無核白（圖4-A、4-B），這說明過表達VqSTS26和VqSTS32可以促進白粉病菌誘導下STS的表達，然而誘導調控的機理仍待進一步研究。芪合成酶是白藜蘆醇合成的關鍵酶，大量研究表明白藜蘆醇作為植保素可以響應真菌病害的誘導[33-34]。ROMERO-PéREZ等[35]研究指出，葡萄果實受白粉病菌感染后芪類物質的含量顯著增加。在植物體內，白藜蘆醇可以生成云杉新苷、葡萄素、紫檀芪等衍生物，已有研究證明葡萄素可以響應葡萄霜霉病[36]，并且它們具有與白藜蘆醇相似的生物活性與醫療保健作用[37]。本研究中，轉基因株系和野生型株系葡萄葉片受白粉病菌誘導7 d后芪類物質含量增加，且轉基因株系芪類物質無論從種類還是含量上均優于野生型無核白（圖4-C、4-D）。因此，過表達VqSTS26和VqSTS32可以促進無核白在白粉病菌誘導條件下芪類物質的積累。

芪合成酶代謝通路屬于苯丙氨酸代謝途徑[38]，芪合成酶與查爾酮合酶高度同源，均以香豆酸輔酶A為底物，前者是白藜蘆醇代謝途徑的關鍵酶，后者是黃酮類代謝途徑的關鍵酶[39]。本研究中自然條件下轉基因株系中CHS的表達量下調（圖5），可能是由于STS與CHS存在底物競爭關系造成的。PAL作為STS的上游基因，是催化合成香豆酸輔酶A的關鍵酶[40]。PAL在轉基因株系中上調表達可能是由于STS的高表達加速了對香豆酸輔酶A的消耗，從而引起PAL表達量提高。RSGT是STS的下游基因，可以催化白藜蘆醇合成云杉新苷[29]。轉基因株系中RSGT的表達量顯著提高（圖5），這與HPLC分析中轉基因株系云杉新苷的含量顯著高于野生型無核白相對應（圖4-C、4-D），原因可能是轉基因株系中STS的高表達促進白藜蘆醇的合成，作為糖基轉移酶的催化底物，白藜蘆醇含量增加引起RSGT表達上調，從而促進白藜蘆醇向云杉新苷的代謝。在其他轉STS研究中也得到相似的結果，如轉STS可以提高獼猴桃果實中云杉新苷的含量[41]；將葡萄STS轉入啤酒花中，云杉新苷的含量提高[42]。MYB14和MYB15是調控STS啟動子的轉錄因子，而在轉基因株系中未有明顯的表達趨勢（圖5），可能是因為轉入的STS受載體CaMV35S啟動子調控引起。這說明，過表達VqSTS26和VqSTS32可以提高轉基因植株STS表達量，并引起其代謝通路上RSGT的顯著上調，因而促進芪類物質的積累。

芪合成酶基因家族不同成員在葡萄中的表達具有時空特異性。VvSTS在葡萄葉片衰老過程中和漿果枯萎過程中表達量提高[24]。‘丹鳳-2’葉片受白粉病菌誘導后VqSTSs表達量均有所上調，但響應程度有所不同[25]。本研究中，接菌后轉基因葡萄葉片STS的定量分析表明白粉病誘導條件下，STS的表達量有不同程度的上調，其中OEVqSTS26-L8株系STS上調水平最為顯著，而 OEVqSTS32-L3轉基因株系則在接菌2 dpi才出現STS表達量的顯著升高（圖4-B），存在個體差異性。VANNOZZI等[24]通過對歐洲葡萄黑比諾STS家族預測蛋白進行聚類分析將其分為group A、group B和group C 3類，其中group B的家族成員表現出對脅迫處理的高度響應。通過‘丹鳳-2’與黑比諾芪合成酶家族氨基酸序列的聚類分析，發現VqSTS26和VqSTS32與group B的家族成員高度同源。綜上所述，可以解釋本研究中VqSTS26和VqSTS32均可以響應白粉病菌誘導又存在個體差異的現象。

轉基因技術是研究基因功能與作物改良的有效手段，在培育高品質、高產量的農作物與經濟作物方面具有十分重要的應用價值。關于葡萄遺傳轉化最早的報道是1990年MULLINS等以體細胞胚為受體材料首次獲得含GUS報告基因轉基因葡萄植株[43]。STS遺傳轉化最早的報道是HAIN等[16]將從花生克隆的STS導入煙草原生質體并發現了白藜蘆醇的積累，隨后又將葡萄STS轉入煙草，增強了煙草對灰霉菌的抗性，這是通過遺傳轉化外源植保素基因提高植物抗性的首次報道[17]。CHENG 等[23]將中國野生毛葡萄VqSTS6轉入歐洲葡萄無核白，驗證VqSTS6可以提高轉基因無核白芪類物質含量并增強對白粉病抗病性，這說明中國野生毛葡萄STS在改善歐洲葡萄抗病性與提高品質方面具有可實踐的應用價值。然而關于轉基因植株接菌前后STS表達與產物特性的對比分析尚未見報道。本研究不僅利用器官發生途徑創建了STS高表達、芪類物質高積累的葡萄新種質；更重要的是對比了接菌前后轉基因植株與野生型無核白在STS表達與芪類物質積累的差異，證明了轉基因植株STS及其產物可以更有效地響應白粉病菌誘導，提高葡萄對白粉病的抗性，為STS及芪類物質參與葡萄抗白粉病提供了重要的理論依據。

4 結論

中國野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS26、VqSTS32轉入歐洲葡萄品種無核白后，不僅提高了STS表達，而且促進了芪類物質的積累，增強了歐洲葡萄無核白對白粉病抗性。因此，中國野生毛葡萄及其攜帶的VqSTS26、VqSTS32是重要的抗病種質資源與基因資源，利用這種資源與歐洲葡萄品種雜交育種創造新的抗病種質，進行歐洲葡萄品種抗性的定向改良與增加芪類物質積累是可行的。