牦牛Linc24063的克隆鑒定及其與miRNAs表達水平的相關性分析

王會 ，柴志欣 ，朱江江 ，鐘金城 ，張成福 ，信金偉

（1西南民族大學，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2西南民族大學，青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041；3西藏自治區農牧科學院, 省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850002）

0 引言

【研究意義】在機體內，lncRNA可通過miRNA發揮調控作用。一方面，lncRNA可作為miRNA吸附劑，與miRNA靶基因競爭性結合miRNA；另一方面，lncRNA可作為競爭性內源RNA（ceRNA），與具有相同miRNA結合元件的mRNA競爭miRNA，抑制翻譯、調節可變剪切或調節 mRNA降解[1]。牦牛主要分布于海拔3 000 m以上的青藏高原地區，為藏區人民提供肉、奶產品。牦牛奶具有高蛋白、高乳脂率的特點，研究 lncRNA在牦牛乳腺組織中的具體功能及調控機制，對更好地利用牦牛遺傳資源具有重要意義。【前人研究進展】在牦牛等哺乳動物中，由于早期配子遺傳的精子和卵子的表觀遺傳修飾不同，導致接近1%的蛋白質編碼基因表達具有親本特異性，這種親本依賴的表觀遺傳現象被定義為基因組印記[2-3]。迄今為止，在人類、小鼠、牛和綿羊等哺乳動物中分別鑒定出350個、236個、45個和18個印記基因（http://igc.otago.ac.nz），這些印記基因通常以簇的形式存在。Dlk1-Dio3印記域位于人染色體14q32、小鼠染色體12q、牛染色體 21q和綿羊染色體18q上，因其在胚胎發育[4]、癌癥的發生[5]、細胞增殖分化[6]及機體各代謝調控通路[7]中發揮重要作用而備受關注，是目前研究較多的印記區域之一。Dlk1- Dio3印記域包括3個父源表達的編碼蛋白基因（Dlk1、Dio3和 Rtl1/Peg11）與母系表達的長鏈非編碼 RNA（如lncRNA:Meg3、Meg8、Meg9）、miRNA 和 snoRNA[8]。研究表明，Dlk1-Dio3印記域在物種間高度保守，廣泛參與到機體各生理及病理過程中。Dlk1-Dio3印記區域的激活與小鼠干細胞多能性水平相關[9]；Dlk1參與調控多能干細胞[10]、肌細胞的增殖與分化[7]；Dlk1啟動子區域甲基化可增加非小細胞肺癌細胞的侵襲能力[11]。LncRNA是長度大于200 bp的一類非編碼RNA，在胚胎發育[12]、細胞增殖分化[13]、精子發生[14]等多種生命過程中發揮重要的調控作用。Dlk1-Dio3印記域上有多個具備重要功能的 lncRNA，如高脂飲食可增加小鼠Meg3表達量，Meg3通過調控FoxO1的表達增強肝臟胰島素抵抗，干擾Met3可逆轉小鼠由高脂飲食引起的血液甘油三酯含量的上調[14]。近年來，人們在不同物種Dlk1-Dio3印記域間發現并鑒定到了新lncRNA，如在鼠Meg8與Meg9、Meg9與Dio3之間分別發現并鑒定了2個lncRNA，即lncRNAB830012L 14Rik和AK044800，lncRNAB830012L 14Rik在小鼠大腦、肺臟、心臟和肝臟組織中廣泛表達[15]，而 lncRNAAK044800主要在胚胎時期的前腦組織中表達[16]；對牛Dlk1-Dio3印記域lncRNA鑒定發現，該區域包含Linc24061、Linc24063、Linc24064三個 lncRNAs，它們在在心臟、腎臟及肌肉組織中均廣泛表達[17-18]。【本研究切入點】前人研究表明，Dlk1-Dio3印記域內的lncRNA，能參與機體多種生物學過程調控。但在牦牛上，未見此印記域內 lncRNA的研究報道。【擬解決的關鍵問題】本研究旨在牦牛Dlk1- Dio3印記域Meg8與Meg9間鑒定牦牛Linc24063，通過生物信息學對其靶miRNA進行預測，結合組織表達譜分析其表達量在乳腺組織中與靶 miRNAs的相關性，從而為牦牛Linc24063通過miRNA發揮功能的調控機制研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年4月，在西藏自治區昌都市類烏齊縣，選取處于第一泌乳期、體重接近、健康的12頭母牦牛，屠宰后采集卵巢、心臟、肝臟、腎臟、乳腺和大腦組織，DEPC反復沖洗后錫箔紙包裝，迅速置于液氮保存，帶回實驗室備用。

1.2 RNA提取及牦牛Linc24063擴增

各組織RNA提取參照Trizol（Invitrogen）試劑說明書。RNA經純度和質量檢測合格后備用。

利用牛Dlk1-Dio3印記域Meg8與Meg9間的序列進行搜索并與牦牛基因組比對，鑒別出牛Linc24063（NCBI登錄號：KU956000.1）序列與牦牛基因組序列高度保守，根據此序列利用 Primer premier 5設計牦牛Linc24063基因5′ RACE（cDNA末端快速擴增）和3′ RACE引物。將牦牛各組織RNA等量混合后，利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech, Palo Alto, CA, USA）按照操作說明書進行 RACE試驗，獲取Linc24063的 5′端和 3′端。5′RACE 引物為：5′-TTAAACATTCCTAACATCTGCC TAC-3′，3′ RACE 引物為 5′-GGGACCCTGAGGCCC AGTCCATTC-3′。

1.3 牦牛Linc24063序列分析

利用NCBI BLAST對牦牛Linc24063序列在物種間的保守性及染色體上的定位進行分析；利用在線軟件Coding Potential Calculator（http://cpc2.cbi.pku.edu.cn/）對Linc24063、已知 lncRNAMeg9（登錄號：NR_132275.2）和編碼基因β-酪蛋白（CSN2，登錄號：MH378280.1）的編碼能力進行預測；利用 miRanda和mireap軟件分析與Linc24063相互作用的miRNAs；利用 DAVID在線軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對與Linc24063相互作用的miRNAs的靶基因進行GO富集和KEGG信號通路分析。

1.4 牦牛Linc24063原核表達

將牦牛Linc24063全長亞克隆至 Pet-28a載體的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點上，獲得Linc24063-28a原核表達質粒，轉化至BL21感受態細胞，獲得含重組質粒Linc24063-28a表達菌種，提取質粒用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定。CSN2-28a原核表達質粒為本實驗室保存。

Linc24063-28a和CSN2-28a誘導表達步驟參照文獻[19]。取 1 mL誘導后的菌液沉淀，用 100 μL的1×SDS-PAGE Loading Buffer重懸沉淀，沸水中煮沸10 min，保證菌體完全裂解。10 000×g離心5 min后，取上清10 μL用于SDS-PAGE分析。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色液染色，脫色液脫色，凝膠成像。

1.5 牦牛Linc24063組織表達分析

利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa, 大連）試劑盒將各組織總RNA反轉錄為cDNA，Linc24063表達量的檢測參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（Takara）說明書，內參基因選擇核糖體蛋白 S9（RPS9，登錄號：XM_005899362.2）、廣泛表達蛋白（UXT, 登錄號：XM_014483477.1）[20]；對于miRNA表達量的檢測利用Stem-loop方法[21]，內參基因選擇5S rRNA。利用Bio-Rad CFX96（伯樂，美國）定量儀進行牦牛Linc24063及 miRNAs組織表達譜分析。擴增體系均為：2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，cDNA 模板 1 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 7 μL。qPCR 條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環。所用引物列于表1。

1.6 數據分析

基因表達量差異分析均使用 2-△△ct法，對于Linc24063的定量選擇UXT和RPS9的幾何平均值進行分析。利用 SPSS 19.0皮爾遜系數（雙尾）反應Linc24063與miRNA的相關性。相關性以|R |≥0.8為極強相關，0.6≤|R |≤0.8為強相關，0.4≤|R |≤0.6為中度相關，|R |≤0.4為不相關。結果表示為平均值+標準誤。*，P＜0.05為差異顯著，**，P＜0.01為差異極顯著。

表1 實時熒光定量PCR引物Table1 Specific primers used for RT-qPCR

2 結果

2.1 長鏈非編碼RNA Linc24063序列特征

利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 擴增牦牛長鏈非編碼 RNALinc24063，結果表明，5′RACE片段大小為476 bp，3′ RACE片段大小為356 bp（圖1-A），測序分析表明Linc24063大小758 bp（圖1-B），位于牦牛21號染色體的Dlk1-Dio3印記域。NCBI blast分析物種間保守性，結果表明牦牛Linc24063與牛、綿羊、山羊的序列相似性分別為98%、90%和90%，而與人和小鼠的序列相似性較低。

2.2 長鏈非編碼RNA Linc24063的鑒定

利用在線軟件Coding Potential Calculator對長鏈非編碼RNA Linc24063、已知lncRNAMeg9和編碼基因CSN2的編碼能力預測分析，結果表明：Linc24063與長鏈非編碼RNAMeg9類似，編碼潛能均較低，明顯區別于編碼基因CSN2，屬于非編碼RNA（表2）。

為驗證Linc24063是否具備編碼能力，本研究將Linc24063連接pET-28a原核表達載體，提取質粒進行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，由圖2-A可知，Linc24063-28a和CSN2-28a分別檢測到一條758 bp和 780 bp大小的片段，進一步通過測序驗證目的片段成功插入原核表達載體。利用原核表達系統在體外對Linc24063和編碼基因CSN2進行翻譯，結果表明：Linc24063在30 kD附近沒有檢測到蛋白表達，表明其不能有效的翻譯蛋白，而在相同試驗條件下，編碼基因CSN2在30 kD附近有蛋白表達，表明CSN2能很好的表達蛋白（圖2-B）。以上研究結果表明，牦牛Linc24063是一個真正的長鏈非編碼lncRNA。

圖1 Linc24063 5′ Race和3′ Race電泳圖（A）及序列（B）Fig.1 The 5′ Race and 3′ Race electrophoresis analysis (A) and the sequence (B) of Linc24063

表2 Linc24063、Meg9和CSN2基因編碼潛能分析Table2 The coding probability analysis of Linc24063, Meg9 and CSN2

圖2 Linc24063的原核表達Fig.2 The prokaryotic expression of Linc24063

2.3 長鏈非編碼RNA Linc24063組織表達譜

利用RT-qPCR技術，筆者研究了Linc24063在牦牛不同組織的表達譜。結果顯示，Linc24063在乳腺表達量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次大腦和腎臟，在肝臟和卵巢中表達量較低（圖3）。

圖3 Linc24063在各組織中的表達量Fig.3 The expression of Linc24063 in tissues

2.4 長鏈非編碼RNA Linc24063生物信息學分析

下載miRbase 22數據庫中普通牛（牦牛的近源物種）和綿羊所有的miRNAs，利用miRanda和mireap軟件分析與Linc24063具有相互作用的miRNA，共發現21個物種間保守miRNAs（表3）。

由2.3研究表明，Linc24063在乳腺的表達量最高，我們推測其在乳腺發育或乳合成過程中具有重要作用，由此結合前人在乳腺中miRNAs表達譜的研究[22-23]，發現13個miRNAs可能在乳腺組織中與Linc24063具有相互作用。對這13個miRNAs的靶基因進行GO富集和KEGG信號通路分析，結果表明，這些miRNAs顯著富集到RNA聚合酶II相關基因的轉錄等生物學過程中（表4）。KEGG信號通路分析表明，這些miRNAs顯著參與到TGF-beta信號通路、PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、MAPK信號通路等（表5）。

2.5 長鏈非編碼RNA Linc24063與miRNAs表達相關性分析

為探究Linc24063與miRNAs的功能相關性，本研究利用RT-qPCR在乳腺組織中檢測Linc24063與 miR-200a 、miR-24、miR-141及 miR-27a的表達量，并進行了皮爾遜相關性分析（圖4），結果表明：Linc24063在12頭牦牛乳腺組織中的表達量與 miR-200a（R=-0.834，P=0.001）和 miR-141（R=-0.657，P=0.02）的表達量均顯著負相關，與miR-27a的表達量顯著正相關（R=0.647，P=0.023），而與miR-24無顯著相關性（P＞0.05）。以上研究結果表明，Linc24063在牦牛乳腺組織中可能通過調控miR-200a、miR-141和miR-27a基因的表達，從而參與到乳腺發育或乳成分合成及代謝的生理過程中。

表3 與Linc24063相互作用的保守miRNAsTable3 The conserved miRNAs interacting with Linc24063

表4 與Linc24063相互作用的miRNAs靶基因的前10條GO富集條目Table4 The top ten GO terms of the conserved miRNAs interacting with Linc24063

圖4 12頭牦牛乳腺組織Linc24063與miRNAs表達量相關性分析Fig.4 The correlation between expression levels of Linc24063 and miRNAs in 12 mammary gland of yaks

表5 與Linc24063相互作用的miRNAs靶基因的信號通路Table5 The KEGG pathway of the conserved miRNAs interacting with Linc24063

3 討論

目前，關于lncRNA的研究不僅局限于模式動物及人上，在豬、牛、羊上也開展了大量研究，但是關于牦牛lncRNA的研究較少。本研究首次通過RACE技術獲取并鑒定了牦牛Linc24063，位于牦牛21號染色體的Dlk1-Dio3印記域，在反芻動物牛、羊中具有較高的保守性（＞90%），與前人對Dlk1-Dio3印記域的研究表明該印記域在物種間具有較強的保守性的結果一致[24]。組織表達譜分析結果表明，Linc24063在所檢測的6個組織中均有表達，且在乳腺中表達量最高，其次是大腦和腎臟，表明Linc24063在這些組織中可能均具備生物學功能。

生物信息學分析結果表明：共篩選到 21個與Linc24063相互作用的物種間保守miRNAs 。結合前人研究對miRNAs在乳腺組織中的表達譜研究[22-23]，筆者篩選了 13個 miRNAs可能在乳腺組織中與Linc24063具有相互作用。對這13個miRNAs的靶基因進行 GO富集和 KEGG信號通路分析表明：與Linc24063相互作用的 miRNAs的靶基因富集到TGF-beta信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素信號通路及與神經發育、保護的軸突引導（Axon guidance）信號通路中。TGF-beta信號通路[25]、PI3K-Akt信號通路[26-27]、胰島素信號通路是與乳腺發育、乳脂乳蛋白合成密切相關的信號通路，結合Linc24063在乳腺組織中表達量最高的特點，推測Linc24063可能在乳腺發育及乳脂乳蛋白合成等生物學過程中發揮重要作用。

為探索Linc24063可能的作用機制，本研究隨機挑選了4個可能與其具有相互作用的miRNAs，在乳腺組織中對其表達量進行了相關性分析。結果表明，Linc24063與 miR-200a、miR-141、miR-27a均顯著相關。前人研究表明miR-200a在乳腺上皮細胞中通過調控β-酪蛋白和E-鈣粘蛋白以維持上皮細胞的極性[28]，同時在乳脂、乳蛋白合成信號通路中發揮重要功能[29]；miR-141和 miR-27a可分別通過調控STAT5蛋白、PPARγ蛋白的表達，參與到乳蛋白、乳脂的合成中[30]。由此可以推測，Linc24063可能通過調控miR-200a、miR-141、miR-27a參與到牦牛乳蛋白及乳脂的生物合成中，但是其具體功能和作用機制還需進行研究。

4 結論

牦牛Dlk1-Dio3印記域存在一個在反芻動物中保守的長鏈非編碼RNALinc24063，全長758 bp。在乳腺及大腦組織中具有較高表達水平，生物信息學分析表明Linc24063可能參與到PI3K-Akt、胰島素等與乳脂乳蛋白密切相關的信號通路中。在乳腺組織中Linc24063與乳脂乳蛋白合成相關的 miRNAs，如 miR-200a、miR-27a和miR-141具有顯著的相關性。以上研究結果為Linc24063的功能研究提供了基礎數據。