長江中下游稻區不同水旱輪作模式和氮肥水平對稻田CH4排放的影響

劉少文，殷敏，褚光，徐春梅，王丹英，章秀福，陳松

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州 311400）

0 引言

【研究意義】全球氣候變暖正日益影響著人類的生存環境和質量[1]，而其發生與溫室氣體濃度的增加有關[2]。CH4作為主要的溫室氣體之一，其增溫效應約占全部溫室氣體總效應的 15%—20%，且每年以1.1%的速度增長[3]。研究發現農田是大氣CH4的重要排放源，約17.9%的CH4排放來源于稻田[4]。水稻是中國重要的糧食作物，其種植面積約占世界水稻種植總面積的 23%[5]。深入研究稻田 CH4排放特點及其影響因素，并在此基礎上制定相應的減排措施，對緩解全球增溫效應意義重大。【前人研究進展】稻田CH4的產生是由產甲烷菌將土壤中有機物質通過厭氧發酵轉化而成[6]，CH4從厭氧沉積層或淹水土壤向大氣傳輸主要經由分子擴散、氣泡迸發和通過植株排放[7]，其中超過90%的稻田CH4通過水稻植株排放到大氣[8]。對稻田CH4排放及相應的減排措施已有大量研究。氣候條件、土壤特性、耕作方式以及田間管理是影響稻田CH4排放的重要因素[9-11]。一般認為水旱輪作能夠改善土壤的理化性質，降低土壤還原物質含量，減少 CH4的產生[12]；而稻田持續淹水，會阻礙氧氣的擴散，降低土壤氧化還原電位，易于產甲烷菌的快速繁殖，導致 CH4排放的增加[13]；中期烤田則能減少36%—65%以上的CH4排放[14-15]。此外，研究表明，秸稈添加能顯著增加稻田 CH4排放量，且排放總量和秸稈還田量呈正相關[16]。在生產上，水旱輪作過程中往往伴隨著冬季作物秸稈全量還田，長江中下游地區主要的水旱輪作包括稻麥、稻油、稻綠、稻閑等模式[17-18]，而近年來，秸稈覆蓋種植馬鈴薯也被廣泛推廣[19]。合理的秸稈還田能增加土壤有機質含量，培肥地力、改善土壤結構[20]，但不同屬性的秸稈還田對溫室氣體排放的影響，目前尚未見系統報道。相關研究表明，田間氮肥施用對稻田 CH4排放亦有顯著影響，但目前尚未有一致的結論，有研究認為氮肥會增加稻田 CH4排放[21-22]，也有研究發現隨著施氮量的增加，稻田 CH4排放減少[23]。由于氮肥會影響還田秸稈的分解及其 CH4轉化過程[24]，因此氮肥對 CH4排放的影響可能還與稻田的秸稈類型有關。【本研究切入點】目前關于水旱輪作模式（不同屬性秸稈還田處理）與氮肥水平對稻田 CH4的排放特性的互作效應研究報道較少，而對其相關排放機理的研究則尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】鑒此，本研究以多年長期定位試驗（2003至今）為基礎，選擇 4種不同水旱輪作模式（不同屬性秸稈還田處理），結合3種不同氮肥水平，通過田間氣體采集與土壤樣品分析，主要目的在于：（1）評估還田秸稈屬性與氮肥水平互作對稻季 CH4的排放規律及累積排放量的影響；（2）結合土壤甲烷代謝微生物、土壤理化性質與秸稈屬性綜合分析，明確不同秸稈還田與氮肥處理下稻季CH4排放差異機理。以期為我國稻田溫室氣體排放以及合理減排措施的制定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗于2016—2017年，在浙江省富陽市中國水稻研究所農場進行（120.2°E，30.3°N，海拔11 m）。該農場位于長江中下游平原，屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為13—20℃，其中7月份為35℃；年平均降水量為1200—1600 mm，其中4月份和9月份降雨量約占80%。本研究所需的稻田種植模式定位試驗于2003年開始實施，于 2016—2017年測定稻田CH4排放，兩年土壤基本性質年度間差異不顯著，具體指標見表1。

表1 不同輪作及氮肥水平下土壤基本性質（兩年平均）Table1 Basic properties of soil under different rotation systems and different N rates（the two years’ average）

1.2 試驗設計

本研究以不同水旱輪作模式長期定位試驗為基礎（2003至今）。于2016—2017年測定稻田CH4排放。定位試驗采用裂區隨機區組設計，4種不同輪作模式為主區，分別為水稻-休閑（RF），水稻-紫云英（RC-G），水稻-小麥（RW）和水稻-稻草覆蓋種植馬鈴薯（RP）；水稻季氮肥水平為副區，分別為N0（0）、N1（142.5 kg N·hm-2）和 N2（202.5 kg N·hm-2），小區位置和面積長期固定，每個小區長8 m、寬8 m，3次田間區組重復。

冬季作物栽培：RF，田間不作任何處理，空閑放置，次年水稻移栽前，翻耕耘田；RC-G，紫云英于10月中下旬播種，出苗后施入尿素15 kg·hm-2作為基肥，次年盛花期（3月底4月初）將其割翻，翻耕還田；RW，小麥于10月下旬11月初撒直播，苗期和抽穗期分別施入復合肥75 kg·hm-2（基肥）和尿素15 kg·hm-2（追肥），次年5月中旬收獲，除籽粒外，其余秸稈翻耕還田；RP，稻草全程覆蓋種植馬鈴薯，于1月下旬在田面上直接擺放種薯，并覆蓋8—10 cm厚稻草，施入復合肥75 kg·hm-2作為基肥，5月中旬收馬鈴薯塊莖，其余部分翻耕還田，還田的有機物為腐爛的稻草和馬鈴薯莖葉等。

圖1 不同輪作模式下秸稈還田量（A）和還田秸稈C/N比（B）Fig.1 Amount (A) and C/N ratio (B) of straw incorporated under different rotations

單季稻種植：供試品種為嘉58（常規粳稻）。水稻田于6月上旬翻耕。水稻浸種催芽后，5月中上旬播于秧田，至3葉1心左右移栽，行株距26.7 cm×13.3 cm。水稻季施氮肥，氮肥總量根據氮肥處理設置，其中基肥∶分蘗肥∶穗肥按照 40%∶30%∶30%施入；磷肥（過磷酸鈣，60 kg·hm-2）作為底肥一次性施入；鉀肥（氯化鉀，135 kg hm-2）按基、蘗肥各50%分次施入。

秸稈還田處理：水稻人工收獲，其秸稈全部移除用于冬季馬鈴薯覆蓋栽培。冬季作物秸稈全量還田，不同輪作模式下秸稈還田量及還田秸稈C/N比如圖1所示。不同輪作模式下秸稈還田量差異顯著（圖1-A，除2017年RW和RC-G差異不顯著），與RP相比，RW和RC-G的秸稈還田量分別減少45.7%和78.3%（2016），51.6%和62.5%（2017）。長期還田秸稈的C/N比（圖1-B）表現為RW顯著大于RP和RC-G（RP和RC-G差異不顯著）；相較于RW，RP和RC-G輪作下C/N分別降低58.0%和71.3%（2016），58.9%和74.1%（2017）。因此，根據秸稈屬性，可以將 4種輪作模式劃分為RP（高秸稈量、低C/N比）、RW（高秸稈量、高C/N比）、RC-G（低秸稈量、低C/N比）和RF（對照-無秸稈）。

1.3 樣品采集與分析

CH4氣體采集于2016和2017年6—10月間開展，采用密閉式靜態（透明）箱-氣相色譜法測定田間CH4排放通量。氣體采樣箱由底座和采樣箱組成，靜態箱底橫截面積為0.5 m×0.6 m，采樣箱由PVC材質制成，箱體高度隨水稻高度而增加（拔節前 0.5 m、拔節后1.2 m），中部固定風扇，箱內嵌有溫度計，方便記錄溫度變化，底座為正方形U槽，嵌入地表，放置箱體后加水使之密封。

采集頻率：水稻自移栽后第3天起，根據實際情況每5—10天采氣1次。采樣時間為8：00—11：00。氣體采集前打開箱內頂部 12 V小風扇以充分混勻箱內氣體，采樣時，將采樣箱垂直安放在底座5 cm深的凹槽內并加水密封，樣品采集分別在關箱后的0、6、12、24 min進行。氣體樣中 CH4濃度由氣象色譜（Agilent 7890A，美國安捷倫科技有限公司）分析測定。CH4檢測器是 FID（氫火焰離子化檢測器），檢測溫度300℃，柱溫 60℃，載氣為 99.999%高純 N2，流速 30 mL·min-1。

土壤及秸稈屬性測定：有機質含量采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定[67]；全氮用全自動凱氏定氮儀（海能 K9840，濟南海能儀器股份有限公司）測定；堿解氮采用堿解擴散法進行測定[67]；土壤pH用pH計（F2，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）進行測定。

鑒于田間試驗處理，年度間基本一致，且經過多年定位試驗，土壤性質基本穩定，因此于2018年分蘗期測定土壤氧化還原電位與土壤mcrA和pmoA基因豐度以探索CH4排放機理差異。

土壤氧化還原電位（Eh）測定（2018年）：于水稻移栽后每5—7天測定一次。利用土壤氧化還原電位儀（FJA-6型，南京傳滴儀器設備有限公司）測定根際土壤中的Eh值。

唐玉煙不好意思地笑了笑，道：“實在抱歉，那天，我蒙蒙眬眬地感覺四周不停地顛簸搖晃，就像地震了一般，后來又感覺一陣窒息，我在窒息中醒來，一睜眼，就發現自己正被一只怪物攜著向前跑，我很害怕，于是拔出刀，割斷了它的脖子。”

土壤mcrA和pmoA基因豐度測定：分別于水稻移栽后 3 d（2018/6/28）、14 d（2018/7/9）、28 d（2018/7/23）利用取土器采集每個小區距稻樁20 cm，耕層（0—20 cm）土壤樣品（5點取樣法取樣），去雜質后混合待用。土壤mcrA和pmoA基因豐度采用實時熒光定量PCR分析。即用土壤DNA快速提取試劑盒提取土壤 DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提 DNA片段大小，并用超微量紫外分光光度計測定DNA濃度及質量。設計產甲烷菌的mcrA基因、甲烷氧化菌的pmoA基因引物，進行實時熒光定量PCR分析，反應體系為20 μL[25]。各基因定量PCR分析所用的引物和反應條件見表2，其中采集信號溫度為72℃。

表2 光實時定量PCR擴增引物及反應條件Table2 Aplification primer and reaction condition of quantitative PCR

1.4 數據處理

溫室氣體排放通量由該氣體在箱中濃度隨時間的變化率計算得出，計算方程為氣體排放通量計算公式如下：

式中，F為排放通量（mg·m-2·h-1）；dc/dt為采樣過程中箱內氣體濃度隨時間的變化率（mL·m-3·h-1)）；h為采樣箱體高度（m）；ρ為標準狀態下氣體的密度（0.714 kg·m-3）；T為采樣時箱內溫度（℃），273為氣態方程常數。每次觀測時各處理氣體排放通量用3次重復的平均值表示；作物生長季節氣體平均排放通量的計算則以相鄰兩次采樣時間間隔為權重，將各次排放通量進行加權平均；氣體累積排放量用平均排放通量和全生長季時間的乘積表示。

本文采用Excel 2010和SAS 9.2軟件對數據結果進行計算和分析，采用 Duncan法分析數據間的差異顯著性（P=0.05）。

2 結果

2.1 稻季CH4排放通量

水稻生長期稻田CH4排放通量的變化受水分管理影響顯著，呈現明顯的階段性變化（圖2），可觀測到兩個排放高峰期—分蘗期和孕穗期CH4排放階段。其中分蘗期CH4排放階段（約移栽后7—30 d）持續時間占全生育期的19.0%—19.7%。分蘗中后期（移栽后 37 d左右），稻田逐漸進入擱田期，各處理 CH4排放通量都表現不同程度下降。擱田復水后，CH4排放小幅上升，進入孕穗期 CH4排放階段（約移栽后50—70 d），該階段持續時間約占生育期的 16.7%—17.2%。之后進入低排放通量周期。

輪作模式對稻田CH4排放的影響因氮肥水平差異而有所不同。N0水平下，分蘗階段CH4平均排放通量，RP、RW和RC-G無顯著差異，但均顯著高于RF，分別提高 72.1%—168.7%、70.8%—145.2%和 56.5%—145.2%（圖2- A 和2-B）。孕穗階段CH4排放通量，各模式間無顯著差異，但2016年RP顯著高于其他。此外，N0水平下分蘗期CH4排放表現為雙峰特點（約為移栽后第12—15 d和25—30 d）。各輪作在移栽后25—30 d出現最大排放峰，RP、RW、RC-G的最高排放通量（兩年平均）分別為55.0、42.9和38.6 mg·m-2·h-1。相比RF，RP、RW、RC-G的最高排放通量分別提高182.1%、120.0%和97.9%。

隨著施氮量的增加，CH4排放通量對輪作的響應出現分化。RF、RP和RW的分蘗期和孕穗期CH4平均排放通量隨著施氮量的增加而顯著提高。N2水平下，RP 分蘗期 CH4平均排放通量為 36.2 mg·m-2·h-1，要比N1和N0分別高14.8%和40.4%；與RP相似，RW則要高13.9%和43.9%。RF則表現為分蘗期CH4排放通量，N1和N2顯著高于N0，尤其在移栽后25—30 d，其平均排放通量達到23.8和27.5 mg·m-2·h-1（兩年平均），相比N0，分別提高29.9%和50.3%。而RC-G分蘗期CH4排放通量保持相對穩定（2017）或略有下降（2016）。與 N0相比，增施氮肥下 RC-G分蘗期CH4平均排放通量降低20.0%—29.8%（N1）和11.9%—20.1%（N2）。

圖2 2016（A、C和E）和2017（B、D和F）年度不同輪作模式及氮肥梯度下稻田CH4排放通量的季節變化Fig.2 Seasonal variations of CH4 fluxes in rice season under different rotation systems and N fertilizer rates in 2016 (A, C, E), 2017 (B, D, F)

2.2 稻季CH4累積排放量

由圖3中可以看出，不同輪作模式及氮肥水平對稻季CH4排放量的影響存在顯著互作。N0條件下，休閑（RF）模式的稻季CH4累積排放量要顯著低于冬季作物種植（RP、RW 和 RC-G）。RF稻季年均 CH4累積排放僅 18.4—21.2 g·m-2，分別比 RP、RW 和 RC-G降低42.6%—59.4%、40.7%—52.1%和36.0%— 52.1%。

隨著氮肥的增加，RP、RW和RF處理下稻季CH4累積排放量均有不同程度的增加。N2水平下，RP、RW 和 RF的 CH4累積排放量分別為 51.2—55.8、45.3—51.5 和 25.0—30.5 g·m-2，比 N0水平提高23.0%—38.4%、26.7%—33.7%和 35.3%—43.5%；而與 N1相比，則提高 9.9%—19.7%、20.8%—23.1%和17.4%—18.8%（2016，RF模式下，N1和N2無顯著差異）。而RC-G稻季CH4累積排放量則隨著施氮量的增加而顯著降低。與N0相比，N1和N2下稻季CH4累積排放量分別降低20.7%—42.4%和10.6%—16.6%。不同輪作間比較，N1和N2水平下，RF和RC-G的稻季CH4累積排放量無顯著差異，但顯著低于RW和RP。

圖3 2016（A）和2017年（B）不同輪作模式及肥料梯度下稻季CH4累積排放量Fig.3 CH4 accumulation emissions in rice season under different rotations and N fertilizer rates in 2016 (A) and 2017 (B)

稻季CH4排放通量還與水稻生育階段相關。為了進一步明確不同輪作模式與氮肥水平下稻季CH4的排放規律，將水稻全生育期分為分蘗期、孕穗期和灌漿期3個主要生育階段。總體而言，稻季CH4的累積排放量分蘗期＞孕穗期＞灌漿期，其中分蘗期、孕穗期和灌漿期占比分別為51.85%—72.31%、22.9%—31.3%和6.0%—20.7%，這表明CH4排放主要集中在生育前中期，而后期占比較小（圖4）。輪作模式和氮肥水平對水稻不同生育階段CH4累積排放量影響顯著，差異主要集中體現在分蘗期和孕穗期，而灌漿期則無顯著差異。N0水平下，與RP、RW和RC-G相比，RF的分蘗期 CH4累積排放量降低 95.9%—171.1%、70.7%—144.1%和74.2%—165.8%；隨著氮肥的施用，各輪作分蘗期CH4累積排放量占比均顯著提高（2016年RC-G除外），增幅為7.0%—48.3%。孕穗期CH4累積排放量，RP和RW模式顯著高于RC-G和RF，而RC-G和RF無顯著差異。灌漿期，CH4排放量較小，各處理之間無顯著差異。

2.3 產甲烷菌（mcrA）和甲烷氧化菌（pmoA）基因豐度

土壤中產甲烷菌（mcrA）和甲烷氧化菌（pmoA）是影響稻季CH4排放的重要微生物。為進一步明確不同輪作模式下稻季CH4排放微生物差異，于2018年水稻移栽后3、14和28 d采集并測定土壤中mcrA和pmoA基因豐度（圖5）。不同輪作模式與氮肥水平下，mcrA和pmoA基因豐度差異顯著。N0水平下，移栽后3 d，mcrA基因豐度量較少，而移栽14 d和28 d后豐度顯著增加。移栽后28 d mcrA基因豐度大小順序為 RP＞RW＞RC-G＞RF，相較于RF，RP、RW 和 RC-G模式下mcrA基因豐度增加195.7%、121.3%和45.7%，這說明秸稈還田有利于提高土壤中產甲烷菌豐度。施氮后，各輪作模式mcrA基因豐度均顯著增加，相較于N0，N1水平下RP、RW、RC-G和RF的mcrA基因豐度分別增加191.4%、135.6%、43.1%和105.7%（移栽后28 d），其中以RC-G增加最少。

圖4 2016（A、C和E）和2017（B、D和F）年度不同輪作模式及氮肥梯度下水稻不同生育階段CH4累積排放量Fig.4 CH4 accumulation emissions at different rice growth periods under different rotation systems and N fertilizer rates in 2016(A, C and E) and 2017 (B, D and F)

與mcrA不同，N0水平下，移栽后14和28 d，RP和RW的pmoA基因豐度顯著高于RF和RC-G。增氮后，RF、RW和RP的pmoA基因豐度顯著減少降幅分別為42.7%、14.1%和13.3%（移栽后28 d），說明氮肥一定程度上抑制了甲烷氧化菌的活性，而RC-G則剛好相反，增施氮肥后pmoA基因豐度增加72.8%（移栽后28 d）。

以上結果表明，隨著氮肥的增施，RP、RW和RF的產甲烷菌顯著提高，但RC-G增加較少；而甲烷氧化菌的豐度變化則與CH4排放剛好相反，表現為RP、RW和RF pmoA基因豐度減少，而RC-G增加。進一步分析mcrA/pmoA比值(圖6-E和6-F)，發現N0水平下，不同輪作模式下 mcrA/pmoA比值大小順序為RP＞RW、RC-G＞RF（移栽后14 d和28 d），其變化規律與稻季不同輪作方式下CH4排放變化基本一致。增施氮肥后RF、RP和RW mcrA/pmoA基因豐度比值顯著提高，其增加比例分別為 71.4%—141.1%、197.1%—258.2%和84.6%—165.5%；而RC-G則下降26.8%—42.3%。這與田間CH4的排放規律相似。

圖5 2018年不同輪作模式及氮肥梯度下產甲烷菌基因（mcrA；A和B）和甲烷氧化菌基因（pmoA；C和D）拷貝數和mcrA/pmoA比值（E和F）Fig.5 Abundance of methanogenic gene mcrA (A and B) and methanotrophic gene pmoA (C and D) and mcrA/pmoA ratio (E and F) under different rotation systems and N rates in 2018

2.4 氧化還原電位差異性

不同輪作模式下氧化還原電位（Eh）變化規律在不同氮肥處理下基本一致（圖6），擱田前（稻田一直處于淹水狀態），各輪作模式 Eh持續下降，在移栽后18—25 d降到最低，然后開始回升，移栽30—35 d以后Eh＞0，并呈波浪式變化。N0水平下，水稻移栽前期（3—7 d），此時各輪作模式 Eh大小順序為RP＞RW＞RC-G＞RF（輪作間 Eh差異不顯著），可能是由于秸稈的添加與機械翻耕增加了土壤的通氣性。移栽后22 d，RP、RW和RC-G模式之間無顯著差異，但均顯著低于 RF模式，降幅為 118.4%、102.6%和80.5%，說明隨著淹水時間的延長，秸稈的降解消耗了土壤中的O2，加速了土壤中氧化還原電位的降低。增施氮肥后，Eh變化幅度因輪作模式而有所差異（移栽后22 d），N2水平下，RP、RW、RC-G和RF的Eh分別為-198.9、-188.5、-156.3和-80.3 mV（RP、RW 和 RC-G模式之間無顯著差異，但均顯著低于RF模式），與N0相比，分別降低33.1%、34.5%、29.7%和24.2%。而與N1相比，則降低7.2%、20.2%、38.4%和 15.9%。無機氮肥的投入，一定程度上促進秸稈的腐解速率，并進一步加速土壤中氧化還原電位的降低。

3 討論

3.1 輪作模式對稻田CH4排放的影響

圖6 不同輪作模式及氮肥梯度下稻季土壤氧化還原電位變化規律Fig.6 Variations of soil redox potential in rice season under different rotation systems and N fertilizer rates

輪作處理與氮肥水平并未改變稻季CH4總的排放規律。受田間水分管理和生長發育影響，稻季CH4排放主要集中在水稻分蘗期，其它時期（如拔節抽穗期、灌漿結實期）相對較少[28-29]。在水稻生長季，CH4排放表現為分蘗期前期升高，中后期特別是擱田開始后降低，擱田結束稻田復水后略有升高，并保持低排放量直至水稻收獲，呈現波浪式變化[5]。

本研究發現輪作模式與氮肥水平對稻季CH4不同階段排放通量及其累積排放量均有顯著影響，其影響主要集中在分蘗期，這與張岳芳[30]和黃太慶[31]等的部分研究結論一致。另外，張嘯林等[32]研究認為添加秸稈和綠肥作物均增加稻季CH4排放，而添加高生物量秸稈比添加低生物量綠肥作物有更多的CH4排放。這與本研究施氮（N1和 N2）處理下不同輪作模式 CH4排放規律基本一致；但在N0下，RP、RW和RC-G無顯著差異。其變化規律還與產甲烷菌基因豐度密切聯系，即添加秸稈生物量與CH4排放之間的關系受氮肥施用調控，并受到產甲烷菌活性的制約。微生物增殖與激活需要底物和能量，而土壤有效碳量是影響土壤微生物活性的限制因子[33]。稻田CH4排放主要受限于產甲烷菌和甲烷氧化菌的豐度及其活性。產甲烷菌是稻田土壤中甲烷產生的主要生物源[34]。而甲烷氧化菌，是以甲烷作為唯一碳源和能源進行同化和異化代謝的微生物[35]。李大明等[36]研究指出產甲烷菌豐度與稻田CH4排放量呈正相關，這與本研究結果一致。秸稈還田與氮肥處理影響了有機碳的轉化和產甲烷菌與甲烷氧化菌可利用的有機碳及能量，進而影響到CH4排放[37]。在種植系統中，秸稈全量還田能夠顯著增加產甲烷菌豐度，進而導致稻田CH4排放量提高[38]。本研究發現N0下，產甲烷菌豐度變化規律與秸稈還田量有關，這與BAO[38]和ARIF[39]等關于大量秸稈碳的投入增加稻田產甲烷菌數量的結果一致。另一方面，稻田CH4排放量也因秸稈還田的有機物料種類而異。前人研究認為添加的有機物料C/N越高，能源物質越豐富，土壤有關微生物活性就越高，在環境適宜的條件下，CH4排放就越多[40]。本研究中RW、RP和RC-G還田秸稈的C/N比分別為70.39、29.25和19.26（圖1 B），其中RP處理C/N較低，但其CH4排放通量顯著高于RC-G，這與其秸稈還田量顯著高于RC-G相符（圖1-A）。顯然，以還田秸稈 C/N比作為判斷還田秸稈對 CH4排放的影響亦不全面。筆者認為與C/N相比，還田秸稈中有機碳含量可能與 CH4排放關系更加密切，但其效應受氮肥施用的影響。此外，長期定位輪作后，RP土壤中較高的有機質含量可能也是導致 RP輪作模式 CH4排放量最大的重要因素（表1）。

3.2 輪作模式和氮肥水平對稻田CH4排放的互作效應

氮肥能夠影響稻田CH4排放，其效應受種類、施用量、施用方式和施用時間等影響[23]。長期還田秸稈的C/N比能干擾增施氮肥帶來的CH4排放效應。在本研究的RP、RW和RF輪作模式中，我們發現，增施氮肥能夠顯著增加稻田CH4排放（圖3），與前人研究印證[41]。但RC-G的表現則剛好相反。這與ZHU[42]和胡安永等[5]關于紫云英-水稻輪作模式不同施氮量下CH4排放研究結論一致。氮肥與有機物料的互作效應對稻季CH4排放的影響主要與有機物料分解及其后續有機物種類有關[43]。一般而言，具有較高C/N比的有機底物，其分解速率隨著氮輸入量的增加而增加[44]。另外秸稈的分解速率還與相關微生物豐度密切相關，后者則受到土壤中有效氮含量的制約[45]，研究發現，在氮受限的環境中，增加氮的輸入提高土壤中氮的有效性，這相應提高了土壤中產甲烷菌所需有機底物的有效性，促進了產甲烷微生物活性，增加CH4產生[46]。本研究進一步發現微生物對氮肥的響應機制因輪作模式而有所差異，增施氮肥促進產甲烷菌的增殖，卻抑制了甲烷氧化菌的增殖（圖5-A，5-B），但其變化幅度因輪作處理而有所不同。這與許欣等[25]關于土壤中可利用氮含量（銨態氮與硝態氮）與mcrA基因豐度正相關而與 pmoA基因豐度呈顯著負相關的結論一致。筆者認為CH4排放對氮肥的響應，原因可能是：（1）產甲烷菌主要以NH4+-N為氮源，外源無機氮的輸入提高了產甲烷菌繁殖所需底物的有效性[46]，會加快產甲烷菌的生理活動[47]，從而促進其群體的快速增長[48]；（2）甲烷單氧酶（MMO）是甲烷氧化菌的關鍵功能酶，可以在氧氣的作用下催化甲烷等低碳烷烴或烯烴羥基化或環氧化[49]，NH4+是MMO的競爭性抑制劑，通過與MMO的競爭，減少了甲烷氧化，促進了甲烷排放[50]；（3）氮素增加還會引起植物根系分泌量增加，進而為產甲烷菌帶來更多生活底物[51]；（4）由于產甲烷菌代謝過程嚴格厭氧，只能生活在氧化還原電位很低的環境中[52]。增加無機氮的投入，能夠加速有機物料的腐解速率，腐解的同時消耗了水中的O2，降低了土壤中的氧化還原電位（圖6-B和6-C），進一步增加了產甲烷菌的數量，進而促進CH4的排放。另外，WATANABE等[53]研究發現，稻田CH4排放與秸稈還田量顯著正相關，當秸稈還田量為 2、4和 6 t·hm-2時，CH4排放量分別增加 19%、97%和 228%，其中秸稈中的碳對CH4排放的貢獻分別為19%、51%和60%。本研究中，RW和RP中秸稈還田量達到15.15和 7.85 t·hm-2，屬于高還田量栽培。微生物利用碳源進行繁殖增長的同時，需要外界提供較高的氮源[46]。而RC-G處理本身帶入秸稈量較少（4.30 t·hm-2），含氮量較高。鑒此，筆者認為稻田系統中秸稈還田C/N的相對含量可能是干擾氮肥水平對稻田CH4排放作用的關鍵。另外，本研究發現，稻田土壤CH4排放量并不是取決于產甲烷菌或甲烷氧化菌中的某一個，而產甲烷菌與甲烷氧化菌基因豐度比值（mcrA/pmoA）能更客觀的反映CH4產生、氧化及排放之間的數量關系，這與LIU[52]等研究結果一致。當土壤中生成的CH4通過擴散進入氧化區域時，大量CH4被甲烷氧化菌氧化。因此稻田土壤的CH4排放量不僅取決于CH4的生成能力，還決定于土壤對內源CH4的氧化能力[54]。本研究表明，相較N0水平下，增施氮肥（N1）顯著增加RF、RW和RP輪作模式mcrA/pmoA比值；而RC-G輪作模式卻正好相反。其變化規律與CH4排放量基本一致。表明紫云英綠肥還田配施氮肥（N1），對土壤中甲烷氧化菌的促進作用強于產甲烷菌，有助于減少稻田CH4排放。

3.3 水稻植株及冬季作物種植對稻季CH4排放的影響

稻田甲烷排放是稻田甲烷產生、氧化和傳輸綜合作用的結果，而水稻的生長強烈影響這3個過程[55]。水稻根系作為重要的中間載體，其根系形態和生理特征嚴重影響CH4排放[56]，而投入的有機物料及其分解后有機物種類對根系的影響程度不同，最終會導致甲烷排放的差異。王紅妮等[57]發現水稻根系為了維持正常的呼吸作用，大量消耗根系附近的氧氣，降低了根系土壤的氧化還原電位，促進了稻田土壤厭氧環境的形成，這也可能是導致不同輪作模式下稻田 Eh差異性的原因之一（圖6）；同時，水稻根系通過分泌物和凋落物的形式為產甲烷菌提供底物，促進產甲烷的增殖[58]。另外，水稻植株也會影響稻田CH4氧化作用，AULAKH等[59]研究指出大氣中的氧氣可以通過水稻植株的通氣組織進入根系，形成一個好氧微區域，促進甲烷氧化菌的生長，氧化稻田土壤中產生的甲烷；稻田土壤中產生的甲烷大約有36%[55]到80%甚至更多[60]在根區微氧區域被甲烷氧化細菌消耗。本研究中紫云英綠肥還田配施氮肥后CH4排放相對較低，是否與水稻植株根系發育程度及其通氣組織有關還有待更深入的研究。筆者認為大量有機物料及無機氮肥的投入對水稻植株及其根系影響程度存在差異，進而造成稻田甲烷產生、氧化和傳輸過程的不同，最終導致CH4排放存在差異。

本研究發現系統中C/N相對含量與CH4排放密切聯系。冬季輪作及冬作后殘留氮會影響土壤中有效氮含量[61-62]，同時也會影響稻季秸稈還田和氮肥施用，這也可能是導致溫室氣體差異的原因之一。土壤中有效氮源（碳源）是微生物繁殖的限制因素，而不同冬季輪作種植能夠影響土壤有機質含量、培肥地力及改善土壤結構[20]，進而改變了微生物代謝的有效有機碳/氮的組成與數量[63]，從而顯著影響相關微生物的生存能力和活性[33]。本研究中，相較于 RF，RP、RW 和RC-G輪作系統下土壤全氮分別提高24.3%、14.0%和7.9%，有機碳分別提高24.2%、7.2%和6.3%（表1）。這與粱愛珍[64]和汪娟[65]等的部分結論一致。土壤全氮是能夠反映土壤供氮能力的重要指標，而有機碳在一定程度上影響著土壤結構及其微生物多樣性，同時又是土壤肥力和基礎地力的最重要的物質基礎[66]。盡管不同處理下，土壤屬性有所差異，但輪作研究中土壤屬性的變化緩慢而微量。而與秸稈還田和氮肥施用帶來迅速且高通量的CH4排放相比，土壤地力的變化是否是影響當季CH4排放的重要因子，有待進一步研究。

4 結論

N0處理不同輪作模式下稻田CH4排放差異顯著，具體表現為RP＞RW＞RC-G＞RF；增施氮肥后，輪作模式與氮肥水平存在顯著互作，RW、RP和RF的CH4排放顯著增加，而RC-G則略有下降；產甲烷菌與甲烷氧化菌基因豐度比值（mcrA/pmoA）與CH4排放規律基本一致。鑒此，筆者認為稻田系統中秸稈還田C/N的相對含量可能是干擾氮肥水平對稻田CH4排放作用的關鍵，當系統中碳冗余時，相關微生物活性受到土壤中有效氮制約，投入無機氮可以減輕氮的限制作用從而顯著提高CH4排放；而碳不足時，繼續投入無機氮，相關微生物繁殖由于受到土壤中有限碳源的限制其活性也會受到抑制，CH4排放相對減少。