姜黃素抗氧化的初步機理研究

□ 崔冬月 李媛媛 肖寶平 劉靜雯, 李健蘇文金李桂玲?

1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021;1

2.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門361021;

姜黃起源于印度，是常用的香料及色素，是制作咖喱不可或缺的主要材料，有高達六千年的食用歷史，且具有較強的保健功效[1]。姜黃素(curcumin, Cur)是姜黃的主要成分之一。它是一種多酚類化合物，也是植物界中很稀少的二酮類色素，為橙黃色結晶粉末，味稍苦，不溶于水[2]，與脂類食物一同食用更易吸收利用。作為姜黃的主要功效成分，姜黃素已通過國家食品藥品監督管理局、糧農組織以及世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會的安全性及毒性檢測[3]。姜黃素因其分子中含有多個雙鍵，以及酚羥基和羰基等活性基團，在護胃、保肝、抗氧化、增強免疫力、減肥等多個保健功效方面都具有很好的作用[1]。在亞洲一些國家,傳統的飲食習慣使人們攝入較少的飽和脂肪酸和含糖食物，而攝入含有豐富的化學防護物質的植物，如姜黃素的攝入量（約 100 mg /d）明顯高于西方國家[4]。在印度等經常攝入姜黃素的國家，肝癌等高發癌癥的發病率遠低于美國[5]。但是，姜黃素的作用機理尚未十分明確，進一步的探究可以幫助指導姜黃素的膳食攝入。

現代醫學研究發現人體眾多病變的引發與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成有關，ROS氧中的自由基可通過致癌基因的激活、抑癌基因的失活、活化致癌物等途徑引發癌癥[6]。因此，增強自由基捕獲能力,消除或減輕自由基所造成的氧化損傷, 是預防和阻斷癌癥發展的有效方法[7]。姜黃素的多種活性與其抗氧化作用相關[8]。本文通過檢測姜黃素對HepG2細胞抗氧化能力的影響，探究其可能的調節機理，可能為姜黃素對ROS相關疾病的預防保健提供理論依據。

方法

細胞培養及姜黃素處理

HepG2細胞購自上海中國科學院細胞庫，培養基為含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養基（SH30022.01，Hyclone），培養在37℃，含 5%CO2的細胞培養箱中。姜黃素處理方法：姜黃素（C1386，Sigma）以二甲基亞砜（DMSO，Amresco）為溶劑，配制成27 mM的母液。將細胞以4×105/ mL的密度接種于六孔板中，過夜培養后加入姜黃素至終濃度5、10、15 μM，繼續培養24小時。

細胞增殖率檢測

將HepG2細胞以1×105/ mL的密度接種于96孔培養板，每孔100 μL。細胞貼壁后，加入姜黃素繼續培養24小時，每孔加入20 μL濃度為 5mg/mL的四甲基噻唑藍（MTT，奧多福尼），37℃孵育4 h后吸棄上清，加入150 μL DMSO以溶解生成的甲臜，繼續震蕩10分鐘，用多功能酶標儀（SYNERGY/H1，Biotek）測定A490，以溶劑為對照計算細胞相對增殖率。

細胞相對增殖率=（OD實驗組-OD本底）/（OD對照-OD本底）×100%

ROS水平檢測

采用活性氧檢測試劑盒（S0033，碧云天），按產品說明書進行操作。即細胞用姜黃素處理24 h后吸棄培養基，加入含10 μM DCFH-DA探針的工作液于37℃孵育30分鐘，然后用Opti-MEM無血清培養基（31985-070，Gibco）清洗殘余染料，最后將細胞收集重懸于無血清培養基中，用酶標儀檢測熒光強度（EX488 nm，EM525 nm），并以樣品的蛋白量進行標準化計算單位蛋白量下的ROS水平。

總抗氧化能力檢測

分別選用碧云天的總抗氧化能力檢測試劑盒S0119和S0116進行檢測。即細胞用姜黃素處理后吸棄培養基，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone）清洗三遍，細胞收集后重懸于PBS并超聲波破碎，4℃ 12000g離心5分鐘后，收集上清夜用于檢測。按照試劑盒說明書設置檢測體系，用酶標儀檢測吸光值，計算單位蛋白量下的總抗氧化能力。最后將對照設為1，計算相對總抗氧化能力。

抗氧化酶活性檢測

分別采用南京建成生物工程研究所總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3-2）和 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測定試劑盒（A005-1-2）、碧云天的過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（S0051）進行檢測。SOD和GPx檢測的細胞處理及蛋白樣品提取同總抗氧化能力檢測，CAT檢測采用細胞裂解液（P0013，碧云天）裂解獲得蛋白樣品。按照試劑盒說明書設置檢測體系，酶標儀檢測吸光值，計算單位蛋白量下的抗氧化酶活性。最后將對照設為1，計算相對抗氧化酶活性。

基因表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測。按 Trizol Reagent試 劑 盒（15596-018，Ambion） 的 說明提取細胞總RNA，并用M-MLV Reverse transcriptase試劑盒（M1705，Promega）將其反轉錄為cDNA，用TAKARA的 SYBR Premix Ex Taq II試 劑 盒（RR820A）在Applied Biosystems的ABI7300實時熒光定量PCR儀中反應并測定，以GAPDH為內參。本文所用qRTPCR引物序列如下：SOD2（GCTGCACCACAGCAAGCACC和 CCAGCAACTCCCCTTTGGGT）、GPx-1（GTGCTCGGCTTCCCGTGCAAC和 CTCGAAGAGCATGAAGTTGGGC）、CAT（GTGCGGAGATTCAACACTGCCA和CGGCAATGTTCTCACACAGACG） 和GAPDH（ATGACATCAAGAAGGTGGTG和CATACCAGGAAATGAGCTTG）。目的基因的mRNA相對表達水平以2-??ct公式進行計算。

統計學分析

數據表示為平均值±平均值的標準誤差（SEM），用SPSS 19分析軟件運用單因素方差分析（ANOVA）進行比較，測定數據均獨立重復三次以上進行統計學分析，＊P＜0.05認為數據差異具有統計學意義。

結果

姜黃素對細胞增殖的影響

姜黃素對HepG2細胞增殖的影響如圖1所示。作用24小時后，細胞增殖率隨姜黃素濃度提高略有下降。此時細胞尚能有效調節代謝，因此選擇5～15 μM為姜黃素作用濃度進行后續檢測。

圖1 姜黃素對HepG2細胞增殖率的影響

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細胞24小時后進行MTT檢測，將對照（溶劑DMSO處理，即姜黃素濃度為0）的增殖率設為100%。計算細胞相對增殖率。統計分析：單因素方差分析（n≥3）。

姜黃素降低ROS水平

圖2 姜黃素對HepG2細胞ROS水平的影響

確定姜黃素作用濃度后，檢測姜黃素對細胞ROS的影響。結果如圖2所示，與對照相比，姜黃素處理24小時后，細胞ROS含量顯著下降(P＜0.05)，提示姜黃素能夠顯著抑制HepG2細胞中ROS的積累。

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細胞24小時后，姜黃素顯著降低細胞ROS水平。結果表示為與對照（DMSO處理即姜黃素濃度為0）相比的DCFH-DA熒光強度，將對照的ROS水平設為1.0。統計分析：單因素方差分析（n≥3），＊P＜0.05。

姜黃素提高總抗氧化能力

進一步檢測姜黃素對細胞總抗氧化的影響。采用ABTS、FRAP法用碧云天的檢測試劑盒進行操作。結果顯示，與對照相比，姜黃素處理后，細胞內總抗氧化能力顯著提高(P＜0.05)（圖3），提示姜黃素能夠顯著提高細胞抗氧化能力。

圖3 姜黃素對HepG2細胞總抗氧化能力的影響

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細胞24小時后，姜黃素顯著提高細胞總抗氧化能力。結果表示為姜黃素處理樣品與對照（DMSO處理）相比的總抗氧化能力（FRAP法和ABTS法檢測），將對照的總抗氧化能力設為1.0。統計分析：單因素方差分析（n≥3），不同字母的數值間有顯著性差異P＜0.05。

姜黃素對抗氧化酶活性及基因表達水平的影響

確定姜黃素提高HepG2細胞的抗氧化能力后，進一步探究其可能的機理。首先檢測姜黃素對細胞抗氧化酶活性的影響，結果如圖4所示。與對照相比，姜黃素處理樣品的SOD及GPx酶活性顯著提高(P＜0.05)，CAT酶活性變化不大，只在大濃度姜黃素處理時略有下降。這提示姜黃素能夠提高抗氧化酶SOD和GPx的活性，而對CAT酶活性影響不大。

最后檢測這三種抗氧化酶基因的表達水平。由于金屬輔機不同，SOD分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/ZnSOD等，其中定位于線粒體的Mn-SOD是清除ROS的主要類型。通過對Mn-SOD（SOD-2）、細胞中的GPx（GPx-1）和CAT的mRNA表達水平檢測發現，與對照相比，姜黃素處理細胞中的SOD-2和GPx-1基因表達水平顯著上調(P＜0.05)，而CAT基因表達水平無顯著變化。

圖4 姜黃素對HepG2細胞抗氧化酶活性的影響

圖5 姜黃素對HepG2細胞抗氧化酶基因表達的影響

大，僅在大濃度姜黃素作用時略有下降。結果表示為姜黃素處理樣品與對照（DMSO處理）相比的酶活性，將對照的酶活性設為1.0。統計分析：單因素方差分析（n≥3），不同字母的數值間有顯著性差異P＜0.05。

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細胞24小時后，SOD-2、GPx-1基因的mRNA水平顯著上升，CAT基因表達無顯著變化。結果表示為與對照（DMSO處理）相比的目的基因表達水平，以GAPDH為內參，將對照的基因表達水平設為1.0。統計分析：單因素方差分析（n≥3），不同字母的數值間有顯著性差異P＜0.05。

討論

姜黃素是世界衛生組織準許使用的食品添加劑，其兩側苯環上的甲氧基能夠增強其抗氧化活性[4]。姜黃素的自由基清除效果強于維生素E多倍，對類自由基的清除作用更強[9]，因此它也被應用于膳食保健。但在姜黃素的體內抗氧化活性研究中，它對不同細胞和動物模型的作用效果和機理不盡相同，且可能通過多途徑產生影響[11]，因此相關機制還在不斷探究中。

ROS中包含的自由基等強氧化物質會造成細胞氧化損傷(oxidative damage)，而氧化損傷與多種慢性病如心血管病、癌癥等密切相關[12]。在正常生理狀態下, ROS維持在較低水平，微量的ROS參與細胞內多種生化反應[13, 14]，而在癌細胞中ROS過量產生，通過誘導基因組不穩定性，修飾基因表達和參與信號傳導等途徑促進癌變發展[15]。近年來的研究發現，降低ROS產生量能夠降低癌癥發病率和病死率[16]，抑制腫瘤細胞增殖和血管生成[17, 18]。因此，控制細胞中ROS的產生對預防癌癥等機體損傷具有積極作用。本研究顯示姜黃素作用24h顯著降低HepG2細胞的ROS水平。這可能是姜黃素激活了細胞內源性的抗氧化防御機制，提高了抗氧化能力引起的。抗氧化酶和非酶抗氧化物質是細胞抗氧化活性的重要組成部分，抗氧化酶中SOD是首當其沖的的第一道抗氧化防線，能催化強自由基超氧陰離子O2·—歧化轉化為過氧化氫，過氧化氫由GPx、CAT等抗氧化酶迅速分解生成水和氧氣。本研究結果顯示，姜黃素能夠顯著提高細胞的總抗氧化能力、SOD和GPx酶的活性，提示姜黃素降低ROS累積可能是由提高抗氧化酶活性、增強抗氧化功能引起的。這與曾瑜等的報道[19]類似, 他們發現急性酒精肝損傷小鼠的血清與肝組織SOD、GSH-Px活力會隨姜黃素濃度增加而升高。

Mn-SOD特異性定位于線粒體，其作用在于維持氧自由基的平衡、清除轉移超氧陰離子自由基、防御氧化損傷。本研究結果顯示，姜黃素能夠顯著提高Mn-SOD、GPx-1的mRNA表達水平，與細胞中SOD和GPx等抗氧化酶活性增加的結果一致。抗氧化酶基因表達量的增加有助于酶活的提高，提示姜黃素可能通過對Mn-SOD和GPx-1基因的調節發揮其抗氧化作用，更詳盡的機制還需進一步深入研究。CAT酶活性僅在高濃度姜黃素作用后略有下降，其基因表達量也無明顯變化，提示在HepG2細胞中CAT的酶活性和表達可能與姜黃素的抗氧化作用無緊密關系。

綜上，姜黃素可以增強HepG2細胞的SOD和GPx酶活性，提高細胞的總抗氧化能力，使細胞中ROS水平下降，Mn-SOD和GPx-1的基因表達上調。姜黃素的抗氧化作用可能是通過調節抗氧化酶的表達和活性實現的，但具體的機理仍有待研究。本研究闡述了姜黃素可能的抗氧化作用機制，可為姜黃素的膳食保健應用提供理論依據及方向引導，但更深入詳細的細胞內姜黃素的生物學功能途徑還有待進一步發掘。