基于GC-MS技術的金錢草干預結晶腎損傷小鼠血清代謝組學研究

杜 毅，丁德英，呂 磊，李 玲

(1．上海交通大學醫學院附屬新華醫院藥學部，上海 200092 ；2．海軍軍醫大學藥學院分析測試中心，上海 200433；3 ．上海東方肝膽外科醫院藥材科，上海 200438)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是指在各種慢性腎實質疾病的基礎上緩慢地出現腎功能減退而至衰竭的一種慢性惡性疾病，其臨床綜合征包括腎功能減退，代謝產物潴留，水、電解質、酸堿平衡失調等全身各系統癥狀[1]。各種原發性和繼發性的泌尿系統病變導致腎臟結構和功能破壞的疾病都會引起腎衰，其中泌尿系統結石已經同高血壓、糖尿病一起被公認為慢性腎病的危險因素[2]。腎結石主要成分為草酸鈣和磷酸鈣，主要的治療手段是外科手術，其發病率高，治療花費大，易誘發尿毒癥。結晶是結石的早期表現，對于其成核、生長以及對小管上皮細胞損傷作用的機制仍缺乏深入了解。由此，對腎臟結晶所造成損傷的早期診斷與針對性治療具有顯著的臨床價值。

金錢草為報春花科植物過路黃LysimachiachristinaeHance的新鮮或干燥全草，主要含黃酮類，苷類，鞣質，揮發油等成分，味甘、微苦、性涼，具有利水通淋、清熱利濕、散瘀消腫之功效[3]。大量的臨床經驗表明，金錢草具有利尿通淋，排除結石之功效，可用于結石的預防和治療[4-5]，然而其作用機制尚不明確。代謝組學是對生物體內盡可能多的代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與機體生理病理變化的相互關系的一種研究方式[6]。它能夠闡明機體的整體代謝狀態，與中醫藥治療的整體觀念相符。本研究利用代謝組學方法探索與結晶腎損傷密切相關的潛在生物標志物，并以金錢草作為干預藥物，探討其對結晶腎損傷的預防治療作用機制，為腎結石的早期診斷治療及金錢草的進一步合理用藥提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Trace GCUltra氣相色譜儀、DSQII質譜儀、FRESCO17臺式冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific)， METTLER AE240 型電子天平(瑞士梅特勒公司)，DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒實驗儀器公司)。

1.2 試藥

丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶(GSH)檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)，甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、核糖醇(Sigma Aldrich公司)，甲醇為色譜純(德國默克公司)，氯仿為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，金錢草(產地：廣西,批號：20171201)購于上海雷允上大藥房。

1.3 實驗動物

SPF級野生型C57BL/6小鼠21只，體重25～30 g，雄性，7～8周齡，海軍軍醫大學實驗動物中心提供。小鼠飼養于保持12 h/12 h晝夜的房間中，給予標準飼料，恒溫(21～23)℃，相對濕度為40%左右，12 h交替照明，21只小鼠在上述條件下適應環境24 h。

2 方法

2.1 動物模型的構建和治療

將21只野生型C57BL/6小鼠隨機分為3組：空白對照組、結晶腎損傷模型組和金錢草干預組，每組7只，24 h適應性飼養后，對模型組和金錢草干預組分別每天腹腔注射乙醛酸鹽100 mg/kg，對照組給予相同體積的生理鹽水，連續注射6 d。同時金錢草干預組每天灌胃給予相當于原藥材1 g/kg劑量的金錢草提取物，連續給藥6 d，對照組和結晶模型組每天給予同體積的生理鹽水，連續6 d。

2.2 樣品收集

按上述方法給藥飼養后6 d后，小鼠眼眶取血，血樣在室溫下靜置45 min，1 500 ×g離心15 min，分離得到上層血清，置于-80℃冷凍保存。處死全部小鼠，行心臟灌流，切取左側腎臟取皮髓質交界處組織，檢測鈣含量、MDA、SOD、GSH、CAT活力水平。

2.3 樣品制備

將凍存的血清樣品置于室溫自然解凍，取血清100 μl，加入400 μl 甲醇(含10 μg/ml的核糖醇內標)，渦旋1 min，4℃靜置10 min，13 800 ×g離心15 min，取上清液200 μl，置于1.5 ml的離心管中，氮氣吹干。

2.4 樣品衍生化

在上述氮氣吹干的樣品殘渣中加入15 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液50 μl，渦旋30 s，置于70℃的烘箱中反應60 min，再加入MSTFA (含1%的TMCS) 50 μl，渦旋1 min，室溫反應30 min，再加入100 μl正庚烷，渦旋30 s，1 500 ×g離心5 min，取上清液100 μl至進樣小瓶。

2.5 GC-MS分析

色譜條件：色譜分離采用 Agilen DB-5MS氣相色譜柱 (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫：起始溫度70 ℃，保持3 min，以4 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，然后以10 ℃/min升至300 ℃并保持6 min，進樣口溫度250 ℃，分流比10:1，傳輸線溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，流速1 ml/min，進樣量1 μl。質譜條件：采用EI離子源，電子能量70 ev，離子源溫度200 ℃；質量范圍(m/z)：50～650 amu；溶劑延遲時間6 min，質譜采集時間50 min。

2.6 數據分析

原始數據經Xcalibur File converter工具轉換為通用的CDF格式。轉換后的數據進一步通過R軟件XCMS程序包進行峰校正和峰積分，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的三維數據矩陣。由于GC-MS本身具有明顯復雜性，同一保留時間下存在多個離子碎片，因此，采用了無靶標過濾的方式，即只保留同一保留時間下峰度最強的離子(保留時間窗為0.01 min)。采用80%規則來去除缺失值，即去除在某一組中出現頻率(非零值)低于80%的質譜離子[7]。為減小樣品制備及儀器不穩定帶來的誤差，在進行模式識別前將數據用內標進行校正，并進行分面積歸一化，將所得的各離子積分數據以Excel格式存儲。將歸一化后的數據導入SIMCA-P V11.0 (Umetrics，Sweden)軟件進行偏最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)，根據相關R2，Q2值對模型進行評價。對差異代謝物進一步進行雙側t檢驗分析(模型組與對照組)，當P<0.05時，認為差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 生物化學指標的測定

生化學指標測定結果見表1。與對照組相比，模型組中鈣含量與MDA含量明顯升高；CuZn-SOD活力，GSH含量及CAT活力顯著下降，而金錢草干預組與模型組相比各指標均發生明顯的回調，表明金錢草提取物對結晶腎損傷具有一定的預防治療作用。

表1 生化指標檢測結果

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與模型組比較

3.2 基于GC-MS的血清代謝輪廓分析

獲取穩定重現的代謝組學數據是代謝組學研究成功的關鍵。為了評價分析系統的穩定性，本研究用等體積混合來自每只小鼠血清作為質控樣品，采用與實際樣品同樣的前處理方法，在樣品序列之前連續進樣6針，并平均分布在實測樣品序列中，一共分析9次。隨機選擇了8個色譜峰(圖1)，考察了其在9次重復分析中保留時間和峰面積的穩定性。結果顯示色譜峰保留時間RSD<0.11%，峰面積RSD<2.82%，表明該分析系統穩定可靠。

3.3 多變量統計分析和潛在生物標志物的鑒定

經過數據處理后，GC-MS數據集得到了141個離子。采用了有監督的PLS-DA方法對兩組數據進行分析，如圖2A 所示，結果顯示對照組和模型組在所建立的數據模型中表現出良好的擬合度和預測能力(R2X=0.85，R2Y=0.96，Q2=0.93)。采用置換檢驗來進行模型驗證，經200次置換檢驗后產生的截距R2=0.256，Q2=-0.289(圖2B)，表明模型具有良好的預測能力和可靠性。VIP值反映了各變量在模型建立中的重要性，本研究以VIP≥1和雙側t檢驗(P<0.05)分析，篩選鑒定了14個與結晶腎損傷相關的代謝產物，結果如表2所示。

3.4 潛在標志物生物學意義的解釋

泌尿系結石是全球性常見病，其發病率約10%～15%，并有逐年增高的趨勢[8]。結晶是結石的早期表現，對結晶腎損傷的研究有助于泌尿系結石的早期診斷。本研究利用代謝組學方法鑒別了與結晶腎損傷密切相關的14種代謝物。查詢KEGG數據庫，我們發現這些代謝物主要涉及嘌呤代謝、氨基酸代謝、糖代謝等途徑。血清中尿素濃度主要受腎功能、蛋白質攝入量和分解代謝情況的影響，血清尿素含量升高通常意味著腎臟疾病的發生，如急性腎衰、慢性腎炎、腎動脈硬化、腎結石等[9]。與對照組相比，模型組中的尿素含量顯著升高，這也與臨床上用血清中的尿素水平來診斷腎損傷程度的方法一致。

與正常組比較，模型組中的多種氨基酸如異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸，脯氨酸含量明顯降低，表明結晶腎損傷小鼠體內存在氨基酸代謝異常。甘氨酸作為抗氧化劑，可以延緩氧自由基對腎臟的損害，通過調節腎臟抗氧化酶、Na+K+-三磷酸腺苷酶、脂質過氧化產物丙二醛和一氧化氮等物質的水平來保護腎臟[10]。模型組中甘氨酸的含量顯著降低，表明小鼠腎臟受損嚴重。支鏈氨基酸在蛋白合成、能量代謝、脂類代謝等方面中起著重要的作用。模型組中纈氨酸和異亮氨酸的含量明顯降低，可能是由于嚴重的腎臟損傷導致機體能量供應不足，從而代償性的利用支鏈氨基酸作為能量的供給。另外，慢性腎臟病晚期患者，因代謝性酸中毒而導致支鏈氨基酸分解[11]，也可能是結晶腎損傷小鼠體內支鏈氨基酸含量下降的原因之一。

乳酸是機體內重要的酸性物質，其代謝與機體內的氧化還原反應和能量代謝密切相關[12]。模型組中的乳酸含量明顯升高，一方面可能是由于乙醛酸鹽誘導的結晶腎損傷導致糖酵解加強，使得以乳酸為底物的糖異生途徑產生阻礙，從而導致乳酸含量的升高；另一方面可能是由于腎臟受損產生大量的自由基，造成組織細胞受損，導致內酶外泄入血，使得各組織細胞中的乳酸脫氫酶含量增加，造成機體乳酸的蓄積。

圖1 小鼠血清典型的GC-MS總離子流圖 A.對照組；B.結晶腎損傷模型組；C.金錢草干預組；1.乳酸；2.β-羥基丁酸；3.甘氨酸；4.脯氨酸；5.D-來蘇糖；6.葡萄糖；7.肌醇；8.硬脂酸

圖2 基于GC-MS數據的正常組和模型組PLS-DA分析的得分圖(A)和置換驗證結果圖(B)

序號保留時間(t/min)分子式代謝物趨勢a代謝通路18.76C3H6O3乳酸↑***糖酵解211.44H2C2O4草酸↑***乙醛酸代謝312.15C4H8O3β-羥基丁酸↑***脂肪酸代謝414.02C5H11NO2纈氨酸↓**支鏈氨基酸代謝515.13CH4N2O尿素↑**嘌呤代謝616.04C3H8O3丙三醇↑*甘油磷脂代謝717.03C2H5NO2甘氨酸↓**谷胱甘肽代謝823.83C5H9NO2脯氨酸↓***精氨酸輔氨酸代謝933.14C5H12N2O2鳥氨酸↓**精氨酸輔氨酸代謝1034.37C6H12O6葡萄糖↓***糖代謝1134.80C6H12O6果糖↓***糖代謝1238.03C16H32O2軟脂酸↑***脂肪酸代謝1338.92C6H12O6肌醇↑***磷脂代謝1441.19C18H36O2硬脂酸↑***脂肪酸代謝

a模型組與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P< 0.001

3.5 金錢草的干預治療

金錢草作為排石之要藥，其臨床作用已得到驗證，但其作用機制尚不明確。以結晶腎損傷相關的標志物為監測指標可以評價金錢草的治療作用。將正常對照組，結晶腎損傷模型組以及金錢草干預組采用無監督的PCA分析，其得分如圖3所示，各組在第一主成分上得到了良好的區分，而金錢草干預組介于模型組和對照組之間，比較潛在標志物的相對含量發現，9種代謝物的含量發生明顯逆轉(圖4)，結合血清生化分析，我們推斷金錢草能夠功能性的調節糖代謝，脂類代謝和氨基酸代謝途徑發揮抗結晶腎損傷作用。

圖3 正常組、結晶腎損傷模型組、金錢草干預組的主成分分析得分圖

圖4 14種潛在標志物在對照組、模型組和給藥組中的相對含量變化 *P<0.05,與模型組比較

4 結論

本研究建立了GC-MS代謝組學分析的方法，通過PLS-DA篩選出與結晶腎損傷密切相關的14種潛在生物標志物，主要涉及了嘌呤代謝、氨基酸代謝、糖代謝等途徑。基于這14種標志物，對金錢草提取物的預防治療結晶腎損傷模型進行了評價，結果表明金錢草提取物能夠回調部分潛在標志物的相對含量，恢復失衡的代謝通路，發揮預防治療作用。本研究為腎結石的早期診斷治療及金錢草的進一步開發應用提供實驗依據。