五倍子酸對 60Co-γ射線輻照人腸上皮細胞的防護效應研究

孫會娟,趙 濤

( 1.陜西渭南職業技術學院護理學院 陜西 渭南 714000； 2.空軍軍醫大學軍事預防醫學系輻射防護醫學教研室，特殊作業環境危害評估與防治教育部重點實驗室，陜西省自由基生物學與醫學重點實驗室 陜西 西安 710032)

現今，電離輻射在醫藥衛生、國防安全、工業加工等眾多領域已被廣泛應用，而人類在享受電離輻射帶來益處的同時也承受著它對健康造成的威脅[1]。目前為止，現有輻射防護劑仍未能攻克毒副作用大、價格昂貴等難題，因而無法廣泛推廣應用。中藥五倍子的主要有效成分五倍子酸(gallic acid，GA)，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗突變等生物活性作用[2]。研究表明，GA能選擇性抑制腫瘤細胞增殖，而對正常細胞無殺傷作用，此特點決定了其作為輻射防護劑研究的可行性[3]。本研究通過觀察GA對60Co-γ射線輻照人腸上皮細胞(HIEC)的防護效應及其作用機制，旨在探尋更加安全、經濟、高效的新型輻射防護藥物，以豐富輻射防護藥物家族。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

GA(純度98 %，空軍軍醫大學藥物化學教研室提供)； RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)(山東四季青生物技術公司)；胰島素(遼寧天醫生物制藥股份有限公司)；磷酸緩沖鹽(PBS)(美國Solarbio Amresco 公司)；姬姆薩(Giemsa)染液(本實驗室自制)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)(南京建成生物公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白質檢測試劑盒(武漢Thermo公司)；RIPA 裂解液(南京碧云天生物公司)；Cyclin D1蛋白、CDK4蛋白(武漢Amresco公司)；β-肌動蛋白(β-actin) ( CST公司)。

1.2 主要儀器

60Co-γ射線(空軍軍醫大學鈷源輻照中心)；低溫離心機(Heraeus公司)；二氧化碳孵育箱(日本池本理化工業株式會社)；酶聯免疫檢測儀(美國Bio-RAD Model680)；熒光顯微鏡(日本Nikon 公司)；Power PacTMHC 高電流電泳儀、Mini-PROTEAN?電泳槽、Mini Trans-Blot?轉印槽(美國Bio-RAD)。

2 方法

2.1 GA配制

精確稱取GA 34.024 mg，溶于10 ml反滲透水，混勻，用0.22 μm濾器過濾，制成20 mmol/L母液，置4 ℃冰箱儲存備用。實驗前用 RPMI 完全培養液，稀釋成不同濃度的GA溶液。

2.2 細胞培養及分組

HIEC細胞培養于含10 %FBS、1 %雙抗的RPMI培養基(0.25 U/ml胰島素)，置37 ℃、5 %的CO2孵箱中培養，48 h更換培養基，待細胞長至指數生長期進行實驗。

將HIEC細胞分為3組，分組如下。①空白對照組：細胞不接受輻照和未經藥物處理；②單純輻照組：細胞接受4Gy60Co-γ射線照射；③GA+輻照組：不同濃度GA作用細胞6 h 后再接受4Gy60Co-γ射線照射。

2.3 GA對HIEC細胞增殖力的影響

取指數生長期的HIEC細胞，接種于3個96孔培養板上，0.8×104/孔，至細胞貼壁后設空白對照組、GA不同濃度處理組，每組設6個復孔。GA濃度為0.1、1、10、20、40、60、80、100、200 μmol/L,分別繼續培養12、24、48 h后，棄掉培養基，加入含10% CCK-8的培養基繼續培養3 h后，用酶聯免疫檢測儀測定吸光度(OD)，測定細胞在450 nm波長處的吸光度，計算細胞增殖率。

細胞增殖率=(實驗組細胞OD平均值-空白對照組細胞OD平均值)/空白對照組細胞OD平均值[4]

上式中實驗組為各GA濃度組。

2.4 GA對受照HIEC細胞克隆形成力的影響

取指數生長期的HIEC細胞，以4×102/孔接種于6孔板內，細胞貼壁后設置空白對照組、輻照組和GA+輻照組。GA+輻照組細胞在照前分別給予終濃度為1、10、20 μmol/L的GA共培養，6 h后接受4 Gy的60Co-γ射線照射，照后1 h內棄掉舊培養液，加新鮮培養液3 ml/孔，繼續培養至照后11 d或顯微鏡下可見50個以上細胞組成的克隆時終止培養，PBS沖洗，甲醇固定20 min，0.8 % Giemsa染色3 h，清洗晾干后顯微鏡下進行克隆計數[3,5]。

克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100 %；

克隆增殖率=[(處理組細胞克隆形成率﹣空白對照組克隆形成率)/空白對照組克隆形成率]×100 %[5]

上式中處理組為各GA濃度組。本實驗輻射條件選取4 Gy的60Co-γ射線照射，劑量率為99 cGy /min，該暴露參數是依據前期預實驗結果而定[3,5]。

2.5 GA對受照HIEC細胞增殖力的影響

取指數生長期HIEC細胞，種植于96孔培養板上，0.3×104/孔，貼壁后按實驗“2.4”項方法分組并進行GA預處理。細胞經4 Gy60Co-γ射線照射后1 h內棄掉舊培養液，加入新鮮培養液2 ml/孔，繼續培養72 h，用CCK-8法檢測細胞活力，計算細胞增殖率計算方法同實驗“2.3”項。

2.6 GA對受照HIEC細胞脂質過氧化能力的影響

接種指數生長期的HIEC細胞于10 cm培養皿上(1.5×105/ ml，4 ml/孔)， 待細胞貼壁后按上述分組及處理。4 Gy60Co-γ射線照射后1 h內棄掉舊液，加入新鮮培養液4 ml/孔，繼續培養48 h后收集上清液，冰上裂解15 min，4℃離心(12 000 g×15 min)，根據試劑盒說明，檢測脂質過氧化指標SOD、MDA和GSH的活力[6]。

2.7 GA對受照HIEC細胞周期相關蛋白表達的影響

HIEC細胞生長至指數生長期，按上述分組及處理后，用Western-Blot法檢測細胞中凋亡相關蛋白Cyclin D1和CDK4的表達。具體操作方法：用100～200 μl的RIPA細胞裂解液冰上裂解20 min，4 ℃離心(12 000 g×15 min)，取上清液用BCA 蛋白試劑盒進行Cyclin D1和CDK4蛋白定量。用10% SDS/PAGE凝膠進行蛋白質電泳，電泳后用PVDF膜轉印，封閉1 h，再與TBST稀釋的一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗分別孵育1～2 h。后用高敏化學發光液孵育，Bio-Rad化學發光儀掃描條帶。樣本中蛋白表達量用Quantity One-4.6.2 (Bio-Rad,Hercule,CA)軟件進行半定量分析處理[7]。

2.8 數據統計與分析

3 結果

3.1 GA對HIEC細胞的毒性實驗

圖1表明：隨作用時間的延長，GA對HIEC細胞表現出一定的毒性作用，但在12 h內GA(0.1、1、10、20、40)μmol/L與對照組相比，對HIEC細胞增殖作用顯著，且0.1、1、10 μmol/L的GA作用更為顯著(P<0.05)，本結果為進一步實驗篩選出最佳的給藥時間和藥物濃度范圍。

圖1 不同濃度GA對HIEC細胞活力的影響 *P<0.05，與空白對照組比較

3.2 GA對受照HIEC細胞克隆形成力的影響

如圖2所示，細胞經4 Gy60Co-γ射線照射后，各輻照組克隆形成能力均顯著下降(P<0.05)。而照前6 h給予GA預處理能顯著改善HIEC細胞的克隆形成力。實驗結果顯示：1、10、20 μmol/L的GA預處理可使HIEC細胞的克隆形成力分別由7.2 %上升到22.7 %、22.1 %和15.7 %，其中1 μmol/L的GA預處理組效果優于(10、20)μmol/L的GA預處理組。實驗表明，GA能減輕輻照所致HIEC細胞克隆形成能力下降的程度。

圖2 不同濃度GA對輻射損傷HIEC細胞克隆形成能力的影響 *P<0.05，與對照組比較

3.3 GA對受照HIEC細胞增殖力的影響

結果如圖3，本實驗條件下，輻照組HIEC細胞活力顯著下降，而照前6 h給予一定程度GA預處理能顯著提高HIEC細胞的增殖能力，其中以(1、20) μmol/L 的GA預處理組作用效果最顯著(P<0.05)。實驗表明，GA可以提高受照HIEC細胞的增殖能力。

圖3 不同濃度GA對輻射損傷HIEC細胞活力的影響 *P<0.05，與輻照組比較

3.4 GA對受照HIEC細胞脂質過氧化能力的影響

實驗結果見表1，與空白對照組相比4 Gy的60Co-γ射線輻照能顯著降低HIEC細胞外代謝物中SOD、GSH的含量(P<0.05)，而給予GA預處理能顯著減輕SOD、GSH下降的程度(P<0.05)，且以10 μmol/L 的GA預處理組作用最顯著。而10 μmol/L的GA預處理與輻照組相比，并未顯著降低MDA水平(P>0.05)。說明本實驗條件下，GA能減輕輻照所致SOD、GSH下降的程度，但對降低輻照后HIEC細胞的MDA水平并未有明顯意義。

表1 GA對輻射損傷HIEC細胞SOD、MDA和GSH活性的影響

*P<0.05，與輻照組比較；#P<0.05，與對照組比較

3.5 GA對受照HIEC細胞周期相關蛋白和激酶表達的影響

本實驗用Western-Blot法檢測了GA對受照細胞Cyclin D1和CDK4蛋白的表達。結果如圖4 A、4 B、4 C顯示：與空白對照組相比，輻照引起Cyclin D1和CDK4水平下降， 照前給藥1 μmol/L 的GA預處理能顯著減輕Cyclin D1和CDK4水平下降的程度(P<0.05)，與輻照組相比(10、20)μmol/L 的GA預處理組能一定程度上抑制Cyclin D1和CDK4水平下降，但差異無統計學意義(P<0.05)。說明GA可以推動輻照所致HIEC細胞由 G1期進入S期，而促進照后細胞增殖[8]。

4 討論

電離輻射誘導的損害主要表現為DNA分子損傷、細胞凋亡、氧化應激、染色體畸變和細胞周期改變等方面，而對細胞膜的損害主要表現為輻射產物羥基和過氧自由基引起的細胞膜脂質過氧化反應[1,3]。輻射防護劑的使用能一定程度減輕輻照所致脂質過氧化反應和細胞周期阻滯，而起到輻射防護作用。

細胞毒性實驗結果顯示：GA對HIEC細胞的細胞毒性作用體現在時效性和量效性兩個方面。時效性表現為隨GA作用時間的延長，GA對HIEC細胞的毒性作用增加，具體表現為：12 h內低劑量組的GA可促進HIEC 細胞的增殖率，無細胞毒性作用；作用后24 h和48 h，不同濃度GA組細胞的增殖率均低于正常對照組，且時間越長，毒性越大。量效性表現為：在不同時間點(輻照后12、24、48 h)隨著GA濃度的增加，其細胞毒性作用增加；但在輻照后12 h組，0.1～20 μmol/L GA對HIEC細胞增殖有促進作用，無毒性作用，且1、10、20 μmol/L GA組與對照組相比，HIEC細胞增殖率顯著上升(P<0.05)。

圖4 GA對受照HIEC細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4的影響 *P<0.05，與輻照組比較

細胞克隆實驗顯示：60Co-γ 射線單照組的HIEC細胞的克隆形成能力降低，與正常組相比，差異有顯著性(P<0.05)。細胞經GA提前6 h預處理，能顯著提高細胞的克隆形成力。與60Co-γ 射線單照組比較，GA(1、10、20 μmol/L)預處理組，HIEC細胞的克隆形成能力顯著增加，有統計學差異(P<0.05)。而1 μmol/LGA預處理組的細胞克隆形成能力增加效果最佳(P<0.05)。

細胞增殖實驗結果顯示：4 Gy60Co-γ射線照射條件下，照前6 h給予不同濃度 GA，能顯著提高HIEC細胞的增殖力，其中以1、 20 μmol/L GA作用效果最顯著。

與正常對照組相比，4 Gy的γ-射線輻照可顯著降低細胞內SOD、GSH的含量(P<0.05)，而給予GA預處理，則能顯著減輕細胞內SOD、GSH的下降(P<0.05)，且以10 μmol/L 的GA預處理組最顯著。而與輻照組相比，10 μmol/L 的GA預處理組能減輕細胞內MDA水平的升高，但并無統計學差異(P>0.05)。說明GA可以降低電離輻射引起的細胞的氧化應激水平。

細胞周期是細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。細胞按照G1、S、G2、M、G1期的順序周期性運轉。Cyclin D1作為細胞周期蛋白依賴性激酶CDKs的調控者,與CDK4或CDK6結合并激活 G1 時期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1 期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的 Rb 蛋白從其所結合的 E2F 轉錄因子上解離，E2F 轉錄因子起始轉錄活細胞周期的基因，從而推動細胞周期由 G1 時期進入到 S 時期，進而促進細胞進行分裂。本研究證明，GA能減輕4 Gy60Co-γ射線暴露細胞Cyclin D1和CDK4水平的降低，促進照后HIEC細胞增殖。

綜合上述研究結果，我們發現：GA能減輕4Gy60Co-γ射線誘導的HIEC細胞損傷，促進受照HIEC細胞增殖能力和克隆形成能力的恢復，其機制可能與GA能降低電離輻射引起的氧化損傷、抑制細胞凋亡、促進細胞周期相關蛋白Cyclin D1和CDK4表達有關。

本實驗提供了一種較為理想的輻射防護候選藥物，為進一步探究其防護作用及作為臨床輻射防護藥物應用奠定了一定基礎。