檳榔醇提物對H9C2心肌細胞的抗缺氧保護作用

趙安鵬，靳 婷,2，王 榮,2

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院全軍高原損傷防治實地重點實驗室，甘肅 蘭州，730050;2.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州，730000)

足夠的氧氣對于機體各部分的生存是至關重要的，對于具有高能量需求的組織(例如心臟)尤為重要。然而，急進高原時，低氧將是機體需要應對的最大挑戰。心肌組織具有耗能、耗氧高的特點，處于低氧環境的心肌出現氧合不足，組織受損，心功能也會產生一定程度的障礙[1]。

氧化應激是引起細胞受損的重要原因之一，出現氧化應激時，細胞內生成大量具有毒性的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和自由基，而心肌細胞非常容易受ROS影響。低氧時，心肌細胞生成大量ROS及氧自由基，引起蛋白質變性、核酸鏈斷裂及膜脂質的過氧化，其主要產物丙二醛(malondialdehyde，MDA)可以作為氧化應激損傷的重要檢測指標。與此同時，心肌細胞內產生的抗氧化物及自由基清除劑也發揮著保護細胞免受損傷的作用，如過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)[2]。所以，抑制自由基的產生或促進內源性的抗氧化作用都能夠減輕心肌細胞的損傷。

檳榔，棕櫚科檳榔屬植物，生物活性較為復雜[3-5]。本課題組的前期研究結果表明[6]，在常壓密閉缺氧實驗中，檳榔無水醇提物能夠顯著增加小鼠的生存時間；在模擬高原急性缺氧及急進高原實地缺氧實驗中，其對大鼠具有顯著的保護作用，但保護機制尚不明確。為了進一步探討檳榔醇提物的心臟保護作用及機制，本研究將使用心肌H9C2細胞構建低氧損傷模型，通過檢測細胞存活率，細胞內抗氧化酶活力的變化及低氧損傷相關基因的變化，研究檳榔無水醇提物對H9C2細胞損傷的保護作用，探討相關機制。

1 材料與儀器

1.1 材料與試藥

H9C2細胞株(編號：GNR 5，上海中科院細胞庫)；高糖DMEM培養基、1×PBS溶液(美國，Hyclone)；胎牛血清(德國，PAN Biotech)；100×青霉素-鏈霉素混合液(美國，Gibco)；D-Hanks溶液、BCA蛋白測定試劑盒(北京，Solarbio)；Cell Counting Kit-8試劑盒(日本，Dojindo)；MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH試劑盒(南京建成)；RIPA強效蛋白裂解液(上海碧云天公司)；95%N2，5%CO2混合器(蘭州苪康商貿有限公司)；TRIzol?Reagent、PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)、RNA-free Water、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(大連，TakaRa寶生物工程公司)；核因子相關因子E2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)引物，由TakaRa合成；沒食子酸標準品(上海源葉生物科技有限公司)；檳榔由聯勤保障部隊第九四〇醫院藥劑科中藥室提供，購自甘肅隴脈藥材有限公司(批號160501)；檳榔提取物為聯勤保障部隊第九四〇醫院高原損傷防治實地重點實驗室制備；紅景天膠囊(中國人民解放軍西藏軍區紅景天研制中心，規格0.38 g)。

1.2 儀器

細胞培養箱(德國，Memmert)；細胞培養瓶(25 cm2，美國，Corning Costar)；Microfuge22R臺式冷凍離心機(美國，Beckman)；倒置顯微鏡(日本，Olympus)；ABI7300實時熒光定量PCR儀(美國，Applied Biosystemes)；Modular Incubator Chamber模塊化培養室(美國，Brincubator)；EST-10-02氧氣檢測儀(深圳希特森環保設備商行)；超微量紫外分光光度計(德國，IMPLEN)。

2 實驗方法

2.1 檳榔無水醇提物的制備

取檳榔切片2 kg，粉碎后過100目篩，取粉末1 kg，加30倍物料體積的無水乙醇后置于回流提取濃縮機(50～60)℃ 4 h，得提取液[7]，將提取液泵入濃縮罐中濃縮至1L，再用旋轉蒸發儀揮干乙醇，濃縮液用冷凍干燥機干燥，收集；加水溶解為3 mg/ml，加入AB-8型大孔吸附樹脂，以60%乙醇洗脫并收集，(40～50)℃旋轉蒸發，濃縮液放入冷凍干燥機干燥，得檳榔無水醇提物[8]。

2.2 總酚含量測定

2.2.1試劑的配制

稱取硫酸亞鐵1.00 g，酒石酸鉀鈉5.00 g，加蒸餾水溶解定容到1 L，得酒石酸亞鐵溶液；稱取磷酸氫二鈉60.20 g，磷酸二氫鈉5.00 g，加蒸餾水溶解定容到1 L，得磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)。

2.2.2標準曲線的制作

以酒石酸亞鐵比色法測定總酚含量[7]，稱取5 mg沒食子酸標準品，加蒸餾水定容至10 ml，得0.5 mg/ml的對照品溶液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml對照品溶液于5 ml容量瓶，蒸餾水補至1 ml，加入1 ml酒石酸亞鐵溶液后以磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)定容至刻度，混勻后靜置15 min，以蒸餾水作為空白參比，在540 nm波長處測定吸光度值(A)。

2.2.3檳榔無水醇提物總酚含量的測定

以60%乙醇為溶劑，配制1 mg/ml的檳榔無水醇提物溶液。取0.2 ml置于5 ml容量瓶，加蒸餾水至1 ml，加入1 ml酒石酸亞鐵溶液，以磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)定容至刻度，混勻靜置15 min后，以蒸餾水作為空白參比，在540 nm波長處測定其吸光度值(A)，平行測定3份。

2.3 H9C2心肌細胞的培養

將H9C2細胞以2×106個/瓶，接種于25 cm2細胞培養瓶(透氣蓋)中，放入細胞培養箱進行培養，條件為37℃，5% CO2，95% RH。等細胞融合度≥75%，進行傳代，置于25 cm2細胞培養瓶(透氣蓋)中繼續培養。

2.4 H9C2細胞低氧處理

選擇對數生長期且狀態良好的細胞，用0.25%胰酶消化，離心，去上清，重懸，接種于細胞培養板中進行相應實驗。常氧組置于細胞培養箱中正常培養。低氧組和給藥組置于模塊化培養室中，給予含有95%N2和5%CO2的二元氣，使用氧探測儀檢測培養小室中氧濃度為0%時停止送氣，關閉閥門，將低氧裝置置于細胞培養箱中培養。

2.5 CCK-8法檢測檳榔醇提物對H9C2細胞存活率的影響

細胞消化、重懸后，吹散到單個細胞數量≥95%后，以10 000個/孔，接種于96孔板，每孔體積100 μl。分別為常氧對照組、低氧模型組、陽性對照紅景天膠囊組、無水醇提物組，其中非給藥組及給藥組的各劑量組均做3個復孔。繼續以正常條件培養24～48 h，待細胞融合度≥70%后，陽性對照組和無水醇提物組分別加入終濃度為5、10、20 μg/ml的含有紅景天或檳榔醇提物的培養基溶液100μl。常氧對照組、低氧模型組加入100 μl/孔的完全培養基。低氧處理24 h、48 h后，吸棄原培養液，用等體積的新鮮培養基清洗細胞2次后，重新加入100μl培養基及10 μl CCK-8液，37℃孵育1 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。

2.6 檳榔無水醇提物對低氧H9C2細胞內氧化應激指標的影響

把H9C2細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，待細胞融合度≥70%后各組分別加入終濃度為20 μg/ml的紅景天或無水醇提物的含藥培養基1.5 ml。低氧處理24 h，吸棄原培養基，用預冷的PBS液清洗3次，每孔加入400 μl RIPA強效蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑PMSF 4 μl)，冰上裂解、破碎后吸取上清，嚴格依照說明書測定相關指標。

2.7 檳榔無水醇提物對低氧H9C2細胞內Nrf2、Caspase3基因mRNA的影響

用Trizol法提取細胞內總RNA，參考TakaRa公司PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒的操作說明書進行逆轉錄cDNA合成。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的操作說明書，按表1所示配制反應體系，在ViiATM 7 DX實時定量熒光PCR儀(Applied Biosystems)上進行PCR 擴增反應。采用2-△△CT方法計算定量PCR的數值進而比較正常對照組與高海拔缺氧組中藥物轉運體的基因表達變化。

表1 Real-Time PCR反應體系

2.8 引物設計與合成

采用Primer 6.0合成引物，并在NCBI官網進行驗證以保證引物設計正確。引物合成由Takara公司完成，如表2所示。

表2 基因引物序列

2.9 統計學處理

3 結果

3.1 檳榔無水醇提物中的總酚含量

以對照品濃度為橫坐標(X)，吸光度值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算得對照品線性回歸方程為Y=15.46X-0.004，r=0.9999，表明沒食子酸在0.01～0.05 mg/ml范圍內線性關系良好。根據線性回歸方程，計算得出檳榔無水醇提物中總酚含量為(41.32±2.61)%。

3.2 不同低氧時間對細胞存活率的影響

實驗結果如圖1所示，細胞存活率隨低氧時間的增加而減小。與常氧組相比，低氧24 h時細胞存活為28.46%(P<0.01)，低氧48 h時細胞存活為16.08%(P<0.01)。而低氧48 h與低氧24 h兩組之間進行比較，細胞存活率無顯著性差異(P>0.05)。所以選擇低氧24 h作為低氧時間進行后續試驗。

圖1 不同低氧時間對細胞存活率的影響 *P<0.05，**P<0.01，與常氧組比較

3.3 不同濃度檳榔無水醇提物對H9C2細胞存活率的影響

由表3可知，與低氧模型組相比，終濃度為5、10、20 μg/ml的檳榔無水醇提物能顯著增加低氧時H9C2細胞的存活率(P<0.01)，細胞存活率分別為38.97%、40.77%、51.65%，與同劑量的紅景天相比，保護作用優于紅景天。20 μg/ml給藥時對低氧細胞保護作用最明顯，所以后續試驗中選擇20 μg/ml給藥。

表3 檳榔無水醇提物對細胞存活率的影響

**P<0.01與常氧空白組比較；#P<0.05,##P<0.01與低氧模型組比較；△P<0.05,與紅景天組比較

3.4 檳榔無水醇提物對低氧H9C2細胞內氧化應激指標的影響

實驗結果如表4，與常氧對照組相比，低氧模型組細胞內丙二醛含量增加了44.33%(P<0.05)，SOD、GSH活力分別下降16.18%、30.64%(P<0.05或P<0.01)，給予濃度為20 μg/ml無水醇提物處理后，SOD、GSH活力分別增加14.90%、28.94%(P<0.05)。無水醇提物處理組細胞內MDA含量，SOD、GSH活力與紅景天處理組無顯著性差異，無水醇提物與紅景天作用無顯著性差異。

表4 檳榔無水醇提物對細胞內MDA含量、SOD活力、GSH活力的影響

*P<0.05,**P<0.01與常氧空白組比較；#P<0.05,與低氧模型組比較

3.5 檳榔無水醇提物對低氧H9C2細胞內Nrf2、Caspase3基因mRNA的影響

實驗結果如圖2所示，與常氧組相比，低氧組細胞內Nrf2基因mRNA相對表達量升高1.74倍(P<0.05)。與低氧模型組相比，無水醇提物處理組細胞內Nrf2基因mRNA相對表達量降低66%(P<0.05)，作用與紅景天無顯著性差異。

圖2 檳榔無水醇提物對H9C2細胞內Nrf2、Caspase3基因mRNA相對表達量的影響 * P<0.05與常氧空白組比較；#P<0.05與低氧模型組比較

4 討論

本研究建立了H9C2細胞體外低氧模型，探究了檳榔無水醇提物對低氧受損H9C2細胞的保護作用，初步闡明其對細胞的保護機制。

在正常情況下，生物體由于細胞代謝而產生活性氧簇(reactive oxygen species ,ROS)，ROS水平的穩態是細胞維持正常形態及功能所必需的。相反，ROS的過量產生將導致細胞基本組成的受損，如DNA、蛋白質和脂質。當自由基的生成量超過了細胞的抗氧化能力時，氧化劑與抗氧化劑比例失衡，細胞發生氧化應激，這也是低氧時組織損傷的最常見原因。Nrf2是近年發現的參與氧化還原平衡調節的重要因子之一，在細胞內源性保護系統中具有重要作用，同時，其對細胞內部氧化還原穩態的改變極為敏感。當機體受到自由基或化學物質等刺激產生氧化應激時，Nrf2被激活，活化的Nrf2遷移入核后與抗氧化反應元件(ARE)結合，發揮調節細胞氧化還原穩態的作用[9-10]。本研究結果顯示低氧細胞內Nrf2基因mRNA表達較常氧組增高，提示低氧導致細胞受到氧化應激刺激，相應的Nrf2被激活。與低氧組相比，無水醇提物處理后細胞內Nrf2基因mRNA表達下調，與常氧對照組趨于一致。雖然提高Nrf2的表達有助于細胞內抗氧化物的轉錄與表達，但我們認為Nrf2的升高也是細胞氧化應激程度的指針，檳榔無水醇提物降低了低氧細胞內Nrf2的mRNA水平可能與其改善細胞的氧化應激狀態有關，相應的降低了Nrf2的應答。其減輕氧化應激的原因可能與增加細胞耐低氧能力，增強細胞內抗氧化酶活性，清除氧自由基等有關。Nrf2信號通路中包含多種蛋白激酶，為了更好的闡明檳榔無水醇提物的抗氧化應激機制，還需要對這些關鍵的蛋白進行相關的檢測，我們將在后期對其進行深入研究。

此外，氧化應激也是誘導心肌細胞凋亡的常見誘因之一。細胞內ROS的異常積累可能導致細胞重要大分子的有害修飾，這些損害累積最終可能通過不同途徑引起細胞凋亡。因此，調節細胞內的ROS可能是減少病理性細胞凋亡的有效方式[11]。Caspase家族在調節細胞凋亡的過程中發揮關鍵作用，可被多種刺激誘導，其中包括氧化應激。Caspase-3是凋亡的關鍵執行者，參與DNA降解，染色質的調控因子冷凝和核碎裂[12]。本研究結果表明，低氧刺激使Caspase-3 在轉錄水平有升高趨勢，而檳榔無水醇提物處理能降低Caspase-3 mRNA 水平，這可能是其提高低氧情況下H9C2心肌細胞存活率的原因之一。更加深入的研究還有待于細胞凋亡的直接檢測以及細胞內促凋亡/抗凋亡蛋白的相關研究等。

綜上所述，檳榔無水醇提物對低氧H9C2細胞有明顯的保護作用，其能提高細胞內抗氧化酶活性，具有使細胞免受氧化應激損傷的作用。